真核细胞染色质往往被紧密地包装成一系列核小体组蛋白八聚体，其核心被147 bp的DNA缠绕， 然后被包含特定限制性核酸内切酶识别位点的DNA序列分隔开。大多数基因组中的染色质都紧紧盘绕在细胞核内，但也有一些区域经染色质重塑后呈现出松散的状态，这部分无核小体的裸露DNA区域被称为开放染色质或染色质可接近区域。

ATAC-seq是一种表观遗传学研究技术，该技术通过转座酶对某种特定时空下开放的核染色质区域进行切割，进而获得在该特定时空下基因组中所有活跃转录的调控序列，并且通过分析染色质开放区域的motif，可以获得潜在的活跃转录因子及其靶基因。

1. 转座子只插入开放的染色质DNA，所以利用Tn5转座酶，将携带测序标签的转座复合物加入到细胞核中，后续利用标签进行PCR扩增，即可识别开放染色质；

2. 转座后成为DNA片段。在72°C延长，与adapter连接，在扩增，随后PCR扩增出来的序列就包含了adapter、共有序列末端、测序标签。

1. 灵敏性高，低起始量细胞，每个样本50000个细胞即可；

2. 最新的优化技术方案，有效降低线粒体DNA的数据污染；

3. 实验步骤简化，实验重复性好，成功率高；

4. 信息量大，能同时揭示开放染色质的基因组位置、DNA结合蛋白、转录结合位点的相互作用；

5. 结果呈现直观，与Chip-seq/DNA甲基化等复杂表观技术相比，ATAC-seq结果简单易懂，可以直接关联到下游基因的转录表达，是表观研究的最佳入门技术。

1. 初步判断所研究的课题是否涉及表观遗传调控机制；

2. 结合基序分析，识别参与调控的转录因子；

3. 识别转录因子调控的靶基因和功能元件；

4. 超级增强子鉴定联合分析，明确活性残基增强子的范围；

5. 通过开放的染色质图谱，可以更好的了解药物或疾病的基因调控和细胞应答机制；识别驱动细胞命运、疾病或应答相关的转录因子。

应用案例一

研究目的：通过比较原发性和肝转移性的小细胞肺癌细胞之间的差异，从而研究人小细胞肺癌促进癌症扩散转移的背景机制

研究方法：ATAC-seq+CHIP-seq

研究结果：ATAC-seq，发现NFI家族转录因子富集在具有差异的染色质开放位点中，表明NFI家族转录因子参与调控肿瘤细胞转移；ATAC-seq+CHIP-seq联合分析，发现在染色质高开放性位点区域伴随着Nfib拷贝数量增多，且Nfib在侵袭性原发性肿瘤和转移性肿瘤内高表达，Nfib表现出维持染色质及远端调控区域开放和促进神经基因表达的功能，说明Nfib对促进癌细胞增殖和迁移具有重要的作用。

应用案列二

研究目的：确定儿童T细胞白血病细胞受阻的发育阶段，并确定白血病发生机制

研究方法：ATAC-seq+RNA-seq

研究结果：ATAC-seq人健康T细胞的7个发育阶段的染色质可及性图谱显示，在T细胞成熟过程中染色质逐渐凝聚；ATAC-seq+RNA-seq联合分析，发现一个与白血病无关的基因DAB1在T-ALLs中过表达、异常剪接和高度可及性。DAB1阴性的患者形成了一个独特的亚群，具有特别不成熟的染色质谱和SPI1（PU.1）的高度可及性结合位点，SPI1是一种对正常T细胞成熟至关重要的TF；对染色质可及性和TF结合位点分析表明，儿童T-ALLs细胞与未成熟胸腺前体细胞最相似，表明早期发育停滞。

分析流程

motif分析

与某些转录因子高亲和度的特定碱基序列称为motif。通过对测序富集位置（peaks）序列的motif分析，预测染色质开放区域结合的潜在转录因子，为后续课题研究思路提供借鉴。

Heatmap分析

ATAC-seq信号通常富集在开放染色质区域，并与基因转录的活跃程度正相关。该热图（heatmap）反应出基因组全部基因的转录因子起始位置(TSS)与终止位置(TES)上下游3kb区域内的reads富集分布情况。

GO富集分析

GO（Gene ontology）是国际通用的基因功能分类体系，按照基因的细胞成分（cellular component），分子功能（molecule function）以及生物过程（biological process）分为3类。进行GO富集能够看到样本在这三大类中的基因分布情况，也可以用于对目标功能的基因的聚集。通过计算数据集的超几何分布，得出基因富集对应GO terms的排序。

KEGG富集分析

随着科学研究的发展，科学家们发现不同的基因间存在着相互作用关系。这些基因相互协调，发挥其生物学功能，展现出生物学现象。针对这一现象，科学家们分门别类的制定出各种pathway。较为著名的有KEGG（KyotoEncyclopedia ofGenesandGenomes）数据库。

样本量

采样建议

一、细胞样本

1.     贴壁细胞

(1)从培养箱中取出贴壁培养细胞，显微镜下观察细胞，确定生长状态良好，密度50-80%左右;

(2)弃去培养基，加入5-10ml PBS清洗一次;

(3)加入适量胰酶，(750ul for 10cm dish)，37°C消化1-2min后，加入5ml含血清，终止消化，用吸管轻轻的吹下贴壁细胞，300g离心5min，去上清，消化成单细胞悬液;

(4)加入适量配制好的冻存培养液【10%DMSO，30%血清(FBS)培养基】;

(5)用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中的细胞数目，最终密度要大于100,000个/500ul/管;

(6)把冻存管放到程序降温盒内，再把程序降温盒放到-80°C的冰箱里，盒内温度会成线性下降。保护细胞不被损伤;

(7) -80°C降温6~24h后，即可准备样本运输；

(8)将冻存管置于密封性好的塑料袋中，用胶布缠到冰袋上，并在泡沫盒中装入足量的干冰进行运输；

(9)为确保实验的顺利，每个样品至少10万个细胞，并制备2~3份重复，以应对不可抗因素带来的风险，避免重新取材、制备、送样。

2.悬浮细胞

(1)确定细胞生长状态良好，加入适量配制好的冻存培养液【10%DMSO，30%血清(FBS)培养基】;

(2)用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中的细胞数目，最终为100,000个/500 ul/管;

(3)把冻存管放到程序降温盒内，再把程序降温盒放到-80°C的冰箱里，盒内温度会成线性下降。保护细胞不被损伤;

(4) -80°C降温6~24h后，即可准备样本运输；

(5)将冻存管置于密封性好的塑料袋中，用胶布缠到冰袋上，并在泡沫盒中装入足量的干冰进行运输；

(6)为确保实验的顺利，每个样品至少10万个细胞，并制备2~3份重复，以应对不可抗因素带来的风险，避免重新取材、制备、送样。

二、组织样本

(1)取下新鲜组织，立即剔除结缔组织和脂肪等杂质;

(2)用预冷的PBS溶液漂洗，将组织表面的残留血液冲洗干净;

(3)如果组织体积较大，应在冰上将组织切成长宽高均≤0.5cm的小块或薄片;

(4)将处理好的组织样本混合均匀后保存于1.5ml离心管中，每管20mg左右(每个样本分装2管)，准确标记样品名称;

(5)迅速置于液氮中速冻，然后转移至-80°C冰箱中保存;

(6)为确保实验的顺利，建议样品制备2~3份，20mg/份，以应对不可抗因素带来的风险，避免重新取材、制备、送样。