m1A修饰发生在腺嘌呤碱基基团的第一位N原子上，并且在生理条件下带有一个正电荷。m1A最早在rRNA和tRNA等非编码RNA中发现，并且在原核及各种真核生物的mRNA中均广泛存在。利用转录组m1A测序技术发现人及小鼠细胞转录组中的m1A在第一个外显子上集中分布，具有m1A修饰的转录本的5'UTR倾向于形成二级结构。此外，m1A修饰与翻译起始位点相关，并且含有m1A的转录本具有更高的翻译效率。

m1A RNA修饰的检测，采用基于抗体富集的甲基化RNA免疫沉淀测序方法（MeRIP-seq），该技术利用m1A特异性抗体富集发生m1A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，对RNA上的m1A修饰进行定位与定量。

1、全面覆盖编码和非编码RNA的m1A化甲基化修饰

2、样本要求低：通过优化打断条件，提高IP效率，改进洗脱条件等可微量建库

3、同时适用于细胞株和临床样本

4、应用范围广：广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域

1、测序平台:Illumina Nova Seq 6000

2、测序模式:PE150

3、测序数据:12G（IP 6G+Input 6G）

研究目的：通过m1A测序探索初级神经元和经历氧-葡萄糖剥夺/复氧（OGD/R）处理的神经元中的m1A转录组景观

样本信息：小鼠正常神经元和OGD/R处理的神经元

测序策略：m1A-meRIP-seq+miRNAseq

结论：OGD/R增加了m1A RNA的数量。m1A修饰可能影响非编码RNA的调节机制，两个重要的发生m1A修饰的lncRNAs分别是Meg3和Neat1，它们可能与lncRNA-RNA结合蛋白(RBPs)相关，并能在mRNA代谢的调控中发挥重要作用。神经元中约有3000个发生m1A修饰的circRNA，它们在神经系统中发挥作用。m1A修饰介导circRNA/lncRNA-miRNA-mRNA竞争内源性RNA（ceRNA），并且mRNA的3'非翻译区（3'UTR）修饰可以阻碍miRNA-mRNA的结合。受m1A修饰影响的基因（Rbfox3和Arid1a）与神经发育和分化有关，未受影响的基因（Grin2d为Wdtc1）主要与更广泛的细胞功能有关，不同模式的基因具有潜在的m1A调节特异性的内在机制。

GO富集分析

GO（Gene ontology）是国际通用的基因功能分类体系，按照基因的细胞成分（cellular component），分子功能（molecule function）以及生物过程 （biological process）分为3类。进行GO富集能够看到样本在这三大类中的基因分布情况，也可以用于对目标功能的基因的聚集。通过计算数据集的超几何分布，得出基因富集对应GO terms的排序。

KEGG富集分析

随着科学研究的发展，科学家们发现不同的基因间存在着相互作用关系。这些基因相互协调，发挥其生物学功能，展现出生物学现象。针对这一现象，科学家们分门别类的制定出各种pathway。较为著名的有KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库。

样本量

一、贴壁细胞

1. 取出贴壁生长细胞，显微镜下观察细胞，确定生长状态良好;

2. 加入3ml的1×PBS(RNase-free 水配制)悬起细胞沉淀，300g离心5min，弃 PBS, 洗 2 次;

3. 加入适量裂解液反复吹打至裂解充分; 参考用量:1mL TRIzol 裂解 106 细胞，最多107细胞；

4. 为确保实验的顺利，建议样品备份2~3 份;

5. 转移至尖底离心管中，-80°C长期保存或通过干冰运输寄出。



二、悬浮细胞

1. 选取生长状态良好的细胞悬液;

2. 200g离心 5min，得到细胞沉淀弃培养基;

3.  加入3ml的1×PBS(RNase-free 水配制)悬起细胞沉淀，200g 离心 5min，弃 PBS，洗 2 次;

4. 加入适量细胞裂解液反复吹打至裂解充分;参考用量:1mL Trizol 裂解 106 细胞，最多107细胞；

5. 为确保实验的顺利，建议样品备份2~3 份;

6. 转移至尖底离心管中，-80°C长期保存或通过干冰运输寄出。



三、组织样本

1. 选取新鲜的动物组织，取材后用RNase-free 配制的生理盐水/PBS 进行漂洗，去除血渍和污物，并剔除结缔组织等非研究组织;

2. 在冰上将样品分割成50mg 左右的小块，以防止样品降解，然后放置于细胞冻存管或 1.5ml EP 管中;

3. 所有动物组织样品取材后立即用液氮速冻≥1h，然后转移至-80°C冰箱中保存;

4. 为确保实验的顺利，建议样品备份2~3 份;

5. 然后将组织样品置于密封性好的塑料袋中，用胶布缠到冰袋上，并在泡沫盒中装入足量的干冰进行运输。



注意事项:

1. 细胞必须裂解充分后再寄送，勿将干冻的细胞直接寄送，因为细胞冷冻的过程中冰晶很容易刺破细胞，此时破碎的细胞会释放内源性RNAse,从而降解 RNA；

2. 细胞裂解是否充分很关键，细胞裂解充分的标志:细胞与裂解液的混合物形成清亮不粘稠的液体，且没有细胞团块残留，如果细胞样品始 终粘度很大，说明该细胞样品仍未裂解充分，此时应继续补加裂解 液，以 100ul 为梯度进行补加，直到样品完全裂解充分；

3. 细胞样品勿用胰酶消化，胰酶会消化细胞膜上的膜蛋白，导致细胞破裂，破裂的细胞会释放RNase 导致 RNA 降解。