m6A是一种常见的RNA甲基化修饰方式，研究表明它在调控基因表达、剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解、介导环状RNA翻译等方面扮演重要角色。吉凯基因的微量meRIP-seq技术，通过特殊的技术优化，大大降低meRIP-seq对样本量的要求，和常规的meRIP-seq需要上百μg的总RNA量相比，微量meRIP-seq仅仅1μg-20μg总RNA量即可满足实验要求。利用最新的去rRNA技术，可以同时检测mRNA、lncRNA及circRNA的甲基化修饰谱，帮助研究人员对RNA转录后甲基化修饰图谱进行全面研究。

1. 样本要求低：500ng~20μg总RNA

2. 同时适用于细胞株和临床样本（包括外泌体样本）

3. 全面覆盖mRNA、LncRNA、circRNA的m6A修饰

1. 测序平台:Illumina Nova Seq 6000

2. 测序模式:PE150

3. 测序数据:20G（IP10G+Input10G）

研究目的：通过m6A测序解析m6A在宫颈癌(CC)肿瘤发生中的作用

样本信息：宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌组织

测序策略：m6A-meRIP-seq

结论：METTL3作为m6A甲基转移酶家族的核心成员，在CC中大幅上调。转录因子ETS1招募P300和WDR5分别介导METTL3启动子中H3K27ac和H3K4me3组蛋白修饰，诱导METTL3转录激活。通过MeRIP-seq确定了TXNDC5为METTL3介导的m6A修饰的靶点，并揭示了METTL3介导的TXNDC5表达依赖于m6A读取器的方式。通过体内外实验验证了METTL3通过调节TXNDC5的表达促进CC细胞增殖和转移。

Motif分析

与蛋白质结合的特定碱基序列为motif， 我们利用HOMER（http://homer.ucsd.edu/homer/ngs/peakMotifs.html）软件对Peaks进行motif分析。

GO分析

GO分类能从各方面描述基因的功能，而GO主要可以分为三个主要的类群，生物学进程（Biological Process，BP），分子功能（Molecular Function，MF）和细胞组分（Cellular Component）。

KEGG分析

KEGG分析是基于基因注释数据库。因此，KEGG分析的关键在于拥有完备的数据库和较完整的Pathway注释。 相对于GO分析，KEGG分析更为直接的让研究者可以很好地对于目标基因进行研究。信号通路分析的目的是基于KEGG数据库去寻找m6A基因显著性富集的信号通路。

组间差异分析

通过找不同样本之间或者疾病组（处理组）与对照组之间的差异，得到某种疾病（或处理条件下）差异的m6A修饰水平，从而在m6A水平上解释吉凯转录组在疾病的发生、发展中的作用。分析内容有以下几个方面：

1.差异Peak

2.差异Peak基因的GO分析、KEGG分析。

样本量

采样建议

一、细胞样本离心收集细胞，然后用1xPBS漂洗1~2次，彻底去除PBS溶液。注意细胞离心收集速度 要适度，一般样本3,000rpm离心5min即可。不要使细胞离心过实而造成裂解液不能充分 渗透，转数过高还会导致细胞破裂，RNA降解。再用充足量TRIzol对细胞进行裂解，裂解 过程中用移液器轻轻反复吹吸，如发现裂解液有明显粘丝现象，表示裂解不是很充分，可以适当增加裂解液的用量，最终应为裂解液澄清，没有细胞碎片团块。裂解在TRIzol中的样品，需转移至-80°C冰箱。参考用量:1mL TRIzol裂解10⁶细胞，最多10⁷细胞。

细胞量:最低不少于5x10⁶细胞（5x10⁶细胞可以提到到大约20ug总RNA）

细胞样本必须是用充足量TRIzol对细胞进行充分裂解，不能直接收集细胞沉淀寄送，以防RNA降解

二、组织样本标本离体后应在最短时间内(<30 min)更换器具切取。每个样本将组织切成3-4块，每块约0.2 cm³大小组织，装入已加入1ml RNA later(Ambion)的2ml RNAase free离心管中， 每个离心管放3-4块。样品4°C放置过夜，使溶液充分渗入到组织中后，再转移至-80°C。 组织量:20mg，最少不少于10mg（注:10mg组织大约可以提取20ug总RNA）。

必须用RNA later充分处理，以防RNA降解

三、全血样本

RNASafer LS Reagent(http://www.magentec.com.cn/products.php?ID=632，不限于这个厂家，其它厂家也可以）；RNASaferTM LS Reagent是专门针对液体样品(血液、唾液、细胞培养液)而设计的RNA保护剂。保护剂中含有阳离子表面活性剂，能快速高效地裂解细胞，并能使RNA形成稳定的电中性复合物，保护RNA不发生降解。血液、唾液、血清、血浆、尿 液、细胞培养液等液体样品和RNASaferTM LS Reagent混合后。可以室温保存三天，在2-8°C保存一个周，或-20/-80°C至少六个月。该方案已经成功运用于细胞培养液，唾液RNA的保护和血液RNA的保护。

a)用合适的容器收集血液、唾液、尿液和细胞培养液等。(血液样本推荐EDTA，禁止使用肝素)

b)立即加入3倍体积RNASafer LS Reagent至样品中。颠倒混匀10-20次，室温静置30分钟

c)该混合液可以室温(15-25°C)保存三天; 2-8°C可以保存一周，-20/-80°C保存至少六个月以上，其RNA不会降解