单细胞转录组测序（ Single-cell RNA-sequencing）是指在单细胞水平上对 RNA 进行高通量测序和分析的新技术。 不同于常规组织或细胞群测序得到的结果（只是大量细胞平均表达水平），单细胞测序能够深入挖掘特异性的信息。 目前 ，单细胞测序已广泛应用于肿瘤异质性、免疫微环境神经科异质性、免疫微环境神经科 、胚胎发育细胞分化等领域的研究。

BD Rhapsody、10x Genomics、DNBelab C4

10x Genomics单细胞捕获建库原理

10x Genomics基于Droplet-based原理，通过微流控、油滴包裹和Barcode标记等技术来实现高通量的细胞捕获。凝胶微珠（Gel beads）上带有特定的核酸引物序列，油滴将Gel Beads与细胞/酶的混合物包裹起来，形成油包水结构GEM（Gel Beads-in-emulsion）。GEMs形成后，细胞裂解，Gel Beads自动溶解释放大量barcode序列，这些序列与mRNA相结合，随后mRNA逆转录产生cDNA；将得到的cDNA进行纯化、富集，用于后续构建标准测序文库。其中，来自同一细胞的cDNA序列均带有对应凝胶微珠所特有的相同的Barcode标签，并且每个cDNA分子各自还会带有特定的UMI标签。

1. 更专业的样本处理能力：吉凯基因拥有近20年的临床样本处理经验，能够处理各种疑难样本，比如：血管、皮肤、骨组织、角膜、视网膜、粘膜等；

2. 更全的单细胞测序平台：吉凯基因拥有BD Rhapsody、10x Genomics国际常用的单细胞测序平台，同时也建设了DNBelab C4国产单细胞测序平台，满足客户差异化的需求；

3. 更稳定优质的数据质量：相同的样本，吉凯基因每个细胞检测出的平均基因数更多，数据背景更干净；样本之间的整体指标数据更稳定；

4. 更丰富的生信分析内容：吉凯基因不仅提供细胞分群、细胞亚群注释、组分分析、细胞周期分析等基础分析，还提供拟时序分析、细胞通讯分析、受体配体分析等多功能全方位的高级分析。

研究目的：运用单细胞RNA测序探索人体肠道的细胞景观

样本信息：健康儿童和成人肠道中的11个不同解剖区域

测序策略：10xGenomics平台

捕获细胞数：428,000个细胞

结论：在整个人类肠道中存在转录上不同的BEST4上皮细胞。肠小簇细胞具有IgG传感功能。神经细胞群存在于发育中的肠神经系统中，先天性巨结肠疾病相关的细胞具有特异性基因表达。在人类早期发育中驱动次级淋巴组织形成的关键细胞程序在炎症性肠病中被采用，以招募和保留炎症部位的免疫细胞。

质量控制

质控是指通过一系列参数尽量排除双细胞、死细胞、多细胞的过程。基于质控后的数据进行的后续分析更准确

细胞分群及注释

细胞分群是依据基因表达量对细胞进行分类的过程，基于标志基因等方式，确定细胞类型是后续各种研究的基础

标志基因可视化

标志基因可视化气泡图常用于展示多个基因在不同细胞群中的平均表达水平，同时展示该细胞群中表达该基因的细胞所占的比例

细胞组成分析

细胞组成分析关注属于每个细胞特征群的细胞比例,该比例可能随着疾病的发生或发育进程而发生改变

细胞亚群分析

细胞亚群分析是指将关注的细胞拿出，再次进行分群的过程。细胞亚分群使得大家可以在更细的颗粒度研究科学问题，例如小鼠中性粒细胞可以被分为G0细胞，G1细胞，G2细胞等（Xie, X., Shi, Q., Wu, P., Zhang, X., Kambara, H., Su, J., ... & Luo, H. R. (2020). Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature immunology, 21(9), 1119-1133）

拟时序分析

伪时间分析（pseudotime analysis）是指通过计算细胞间基因表达量的渐变关系，预测所有细胞在一条或多条虚拟的时间线上的先后顺序，构建出细胞的发育或分化轨迹。常用于发育过程的样本，或药物处理后的时间序列样本，可以用于找到随时间变化，或在发育或分化节点起关键作用的核心基因

细胞时序变化：

细胞类型变化：

随伪时间变化的关键基因：

随伪时间变化的基因热图：

细胞通讯

细胞通讯（cell communication）是指细胞接收、处理和传递与环境和自身的信号的能力，它是每个生物体 （如细菌、植物和动物）中所有细胞的基本属性。CellPhone/CellChat可基于数据库&基因表达量推断不同细胞类型间存在的系统通讯关系

细胞间通讯强度：

配受体分析：

转录因子调控

转录因子（Transcription Factor, TF）是指通过结合基因上游特异核苷酸序列，进而调控该基因转录的蛋白质。多个转录因子协调，驱动基因表达，构成了复杂的转录因子调控网络，这些调控网络影响了细胞的增值、分化甚至疾病的发生。基于pySCENIC，我们可以推断单细胞转录组数据中存在的转录因子及其靶基因，并构建调控网络，以直观查看基因表达调控关系

RNA velocity分析

基于对RNA分子是剪接的还是未剪接（即仍包含内含子序列的新生RNA）的评估。RNA velocity能够预测给定细胞未来的基因表达状态

伪时间变化：

细胞类型变化：

inferCNV分析
InferCNV可以用于肿瘤单细胞RNA-Seq数据中鉴定大规模染色体拷贝数变异，例如整个染色体或大片段染色体的扩增或缺失

GSEA

基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis/GSEA）通过评估一个预先定义的基因集的基因在与表型相关度排序的基因表中的分布趋势，从而判断其对表型的贡献

GSVA
基因集变异分析(Gene Set Variation Analysis / GSVA)，是一种非参数的无监督分析方法，主要用来评估转录组的基因集富集结果

样本量

样本准备

(一)组织样本

1.根据项目设计的要求，采集临床手术样本或者动物模型样本。取材后，将组织切成0.5cm×0.5cm×0.5cm小块，可以收集2-3小块组织，重量约200-400 mg，迅速放入组织保存液中，组织保护液务必提前4°预冷，组织应完全浸没在组织保存液中，

(二)血液样本

避免气泡，封口膜封闭管口，置于冰上或4°C短暂存放。

◆注意:组织保存液的体积应不小于采集样本体积的5倍，日常存放于4°冰箱保存;严禁用干冰或者液氮速冻或放在-20°C、-80°C冰箱中保存

1. 采用EDTA抗凝管收集血液，血液采集量3-5 mL。

2. 采集好的血液应置于冰上或4°C短暂存放。◆注意避免溶血以及凝血。

包装1.用油性记号笔标记样本，避免与乙醇等有机溶剂接触(需在取材前准备好)。

3. 填写《技术服务单》 ，在填写时应当详细标明样本名称、样本类型等相关细节， 以便技术人员确定合理的实验方案。

4. 将足够量湿冰或蓝冰(蓝冰袋一定不能在-20°C或者-80°C冷冻)装入泡沫箱中，再将标记好的样本正面朝上放入湿冰或蓝冰中心位置。

5. 寄送样本时需随附文档《上样登记单》。

◆蓝冰用量:（4℃冷链运输）

长三角：＞4-5个

北广：＞6个

其它地方：＞7个

说明:

◆以上用量不包括夏季，夏季天气炎热，蓝冰需多增加3~5个冰袋。

运输

1. 上门取样

2. 快递寄送

（1）提前联系本公司销售人员，由销售人员或指定的冷链运输公司上门收取标本，在48小时内送达本公司进行后续的细胞分离等实验

（2）自己联系冷链运输公司寄送样本，在48h内将样本送到公司