蛋白翻译后修饰（Post-Translational Modification，PTM）赋予了单个蛋白质功能多样性的特性。在众多翻译后修饰中，磷酸化（Phosphorylation）修饰是最常见、最重要也是最被广泛研究的蛋白质修饰。蛋白质的磷酸化由蛋白激酶（Protein Kinase）催化，将ATP或GTPγ位的磷酸基转移到底物蛋白质的特定氨基酸位点上（主要是丝氨酸Ser、苏氨酸Thr和酪氨酸Tyr）。

磷酸化修饰是可逆的，去磷酸化由蛋白磷酸酶（Protein Phosphatase）催化。蛋白质磷酸化状态影响蛋白功能的激活或抑制，磷酸化修饰调节参与细胞内几乎所有的生物学过程，在调控细胞增殖、分化、发育、凋亡中发挥重要作用。生理活动以及疾病发生发展过程中都伴随着磷酸化的调控。因此，研究蛋白质的磷酸化修饰状态对生理病理研究中有着重要意义。

5D label free磷酸化蛋白质组学是在传统4D label free磷酸化蛋白质组学技术的基础上，引入了新的鉴定维度，助力蛋白质组学开启“5D”模式。基于PaSER^TM的5D磷酸化蛋白质组学在保持更严格的假阳性率（FDR）的情况下，能够大幅提高肽段和蛋白质鉴定数目，刷新了业内蛋白质组服务新标准、新高度。

适用于小规模样本的磷酸化蛋白质组学特征分析、高深度磷酸化修饰检测、信号通路/调控通路研究、疾病作用机制、激酶或磷酸化底物发现等研究。

5D label free磷酸化蛋白质组学项目流程包括样本准备、实验室样本制备（含蛋白质抽提、酶解成肽段、磷酸化肽段特异性富集）、上机检测、数据预处理（PaSERTM软件搜库）、生信挖掘等5大环节。

1. PaSER^TM大有来头：前沿领先的机器学习搜库算法，集合了蛋白质组学领域权威专家最前沿的科研成果

PaSER^TM搜索引擎整合了蛋白质组学领域权威专家美国Scripps研究所的John Yates III教授（2019年ASMS质谱杰出贡献奖获得者）和德国柏林Charité医学院的Markus Ralser教授的最新科研成果，相关搜库算法曾经发表在Nature Methods和Journal of Proteomics等权威期刊上，可谓当今最前沿领先的搜库算法。

PaSER^TM系统是一个并行数据库搜索引擎，可以“实时”搜索（Run and Done），智能化决定样本列队分析进程，每个样本采集结束时，通过将实验结果与预设的蛋白质或肽段鉴定数量标准比对，来决定样品队列继续与否，该功能可核验方法的适用性、节省稀有样本、昂贵耗材和机时。

2. 更高的鉴定深度：相较于4D label free磷酸化检测，PaSER^TM加持下的5D label free磷酸化位点检出数量平均提升超200%。

磷酸化蛋白质组技术存在不同技术路线，每种技术有其技术优势，可根据样本数量以及对数据质量的要求进行综合选择。各类技术特点如下。

1. 丰富的样本处理经验，支持各类科研需求；

2. 严格的质量标准，优秀的技术检测能力；

3. 追求极致的报告体验，提供三套差异筛选标准结果，报告解读、数据挖掘视频及中英文方法说明等，详情点结果示例；

4. 专业的售前售后服务，及时响应客户消息，全力解决客户问题。

吉凯基因一直致力于提供专业的蛋白质组学服务，基于蛋白质组学数据挖掘需求以及对高水平文章的生信分析内容的分析，吉凯基因蛋白质组学报告提供20多项标准分析，远超行业常规交付标准，助力广大科研用户数据挖掘轻松又高效！

1.  多种样本平行性及质量评价维度：从源头上把控数据质量，以提高分析结论的可靠性、可重复性

2. 三套差异筛选标准：让每套数据找到最适合的标准

3套差异筛选结果一览表（示例）

3.  提供关键蛋白质候选列表：让临床科研更轻松、高效。

关键磷酸化蛋白质候选列表（表头示例）

4.  多种GO/KEGG富集分析结果呈现方式

5.  交互式蛋白质互作PPI：支持个性化排版，悬浮显示蛋白质的多项特征信息

6. 磷酸化保守基序（motif）分析：挖掘磷酸化位点共性，为上游激酶预测和磷酸化机制研究提供支持

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7. 蛋白质动态分布范围图：展示蛋白含量高低，高低丰度一清二楚

蛋白质动态分布范围图

8.  多组比较提供韦恩分析：展示多比较组的共有和特有差异蛋白质

期刊: ACS Applied Materials & Interfaces

影响因子:10.383

发表单位：普渡大学

发表时间: 2021年1月

一、研究背景

细胞外囊泡(EV)具有磷脂双层结构，在唾液、尿液和血浆等体液中普遍存在。它们携带着有价值的信息，在细胞间通讯、发病机制和应激反应中发挥重要作用。近年来，人们对其在多种疾病，特别是癌症和神经退行性疾病的诊断和治疗中的应用前景进行了多方面的探究，且已经取得了重大进展。对细胞外囊泡的研究需要高效的分离方法，而传统技术如超速离心、密度梯度离心、免疫亲和法等均存在耗时长、成本高、回收效率差、纯度低等缺点，迫切需要新的、高效的分离方法，以加速细胞外囊泡的研究。

二、研究结果

1. 新的双功能磁珠法（BiMB）能更高效地分离细胞外囊泡

研究人员开发出一种新型的细胞外囊泡分离磁珠：双功能磁珠BiMB，并比较了新磁珠和仅Ti(IV)固定的磁珠（TiMB）及仅用DSPE固定的磁珠（DspeMB）之间的分离效率。透射电镜、纳米粒子跟踪分析技术（NTA）和WB等细胞外囊泡鉴定技术的结果表明，BiBM法分离获得的细胞外囊泡具有完整膜结构，平均粒径为125.7nm，且膜上表达CD9、CD63蛋白。与传统超速离心法（UC）比较发现，BiMB方法有最高的分离效率，CD9表达强度分别为：BiMB(81%) > TiMB(69%) > DspeMB(61%) > UC (30%)。TiMB和DspeMB都是基于化学亲和原理捕获细胞外囊泡，相较UC法具有更高的分离效率，而新方法BiMB可进一步提高分离效率。

2. 4D蛋白质组学结果显示BiBM有更好的性能

进一步，研究者使用4D质谱技术对不同分离方法获得的尿液细胞外囊泡进行蛋白质组学检测。BiBM分离的细胞外囊肿检测到了最多的肽段（36262个）和蛋白质（3302个）。将这些蛋白质与ExoCarta上发表的前100种外泌体蛋白质标志物进行比较发现，有95种重合蛋白，为4种方法中与数据库重合数量最高的。后续对13种外泌体蛋白标志物和3种尿液特异标志物进行定量分析，基于磁珠分离方法的结果均有更高的信号强度，显著优于UC法。

3. 4D磷酸化蛋白质组学检测及发现不同位点磷酸化的同分异构体肽段

紧接着，研究者使用4D磷酸化蛋白质组学技术对利用BiBM法从前列腺癌患者和健康对照尿液样本中分离出的细胞外囊泡进行检测（每组10人，且尿液混为一个样本，重复检测3次）。前列腺癌组和健康对照组分别鉴定到6823和6726个磷酸化肽段，分别来自1564和1413个蛋白质。前列腺癌组和健康对照组相比，得到121个上调磷酸化蛋白，103个下调磷酸化蛋白。上调磷酸化蛋白富集富集在信号转导、蛋白质磷酸化等相关GO-生物过程条目、膜结合细胞器和细胞外区域等GO-细胞组分条目，以及和蛋白激酶活性有关的GO-分子功能条目。KEGG通路富集分析表明，这些磷酸化蛋白主要参与癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt/AMPK信号通路和前列腺癌通路等。

最后，研究者利用4D质谱仪可以根据离子淌度维度区分不同位点磷酸化的同分异构体肽段的性能，发现了263个潜在的磷酸化同分异构体肽段，来自63个上调磷酸化蛋白。其中176个异构体与癌症相关，17个与前列腺癌相关。研究者举例展示了在前列腺癌组中的两个不同位点磷酸化的同分异构体肽段：SLsDSESDDSK和sLSDSESDDSK。它们来自蛋白CBX3，有相同的质荷比、保留时间和氨基酸序列，仅磷酸化的氨基酸位置不同。这两个同分异构体因其离子淌度的CCS值（碰撞横截面积）有微小差异，最终被4D质谱仪区分和检测。研究者强调，4D质谱仪这种能够通过离子淌度区分同分异构体的能力能帮助研究者获得关于癌症相关磷酸化位点甚至它们的相对丰度的更准确的信息。由于检测离子淌度提供了具体的CCS值这种多一维度的信息，它可能使PTM（蛋白翻译后修饰）分析得到更广泛的应用。

三、研究总结

研究者开发一种高效、特异的从体液类样本中分类细胞外囊泡的方法——双功能磁珠法（BiMB）。通过对多种分离方法的细胞外囊泡捕获效率、纯度、蛋白质组学结果（4D质谱仪检测）的评估，研究者发现，BiMB相较于仅用Ti(IV)固定的磁珠法（TiMB）及仅用DSPE固定的磁珠法（DspeMB）及超速离心法（UC）有最优的性能。研究者随后对利用BiMB法分离的前列腺癌患者和健康对照个体尿液样本的细胞外囊泡进行4D磷酸化蛋白质组学检测，并分析了差异变化的磷酸化蛋白及富集到的GO功能和KEGG通路。最后，研究者根据4D质谱仪利用第四维度离子淌度区分同分异构体肽段的性能，在前列腺癌组中分析得到了176个不同位点磷酸化的同分异构肽段，这将为蛋白翻译后修饰的研究提供新的信息，可能拓展其更宽广的应用。

1. 样本寄送流程

注意：所有样本均应标明准确的样本编号，同时配有一张样本登记表，写明样本名称、物种、编号、取样日期、样本处理情况等。

2. 样本寄送地址

上海市浦东新区张江高科爱迪生路332号仓库。

3. 取样原则

（1）代表性原则

取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义，因此您应该根据实验目的慎重选择您的取样方案。

病变组织样本中应不夹带正常组织，正常组织样本中不能含有病变组织。有条件时，应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致，否则可能会影响实验结果的可信度。

（2）准确性原则

代表性样本的各种特征数据必须被准确记录，并按要求（低温、迅速）采集、制备、贮存、运输，最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。

（3）迅速性原则

样本质量是蛋白质组学实验中影响实验结果的最关键因素，因此用于蛋白质组研究的样本，在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速，最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。

（4）低温原则

所取样本离体后，应尽快置于液氮（首选）、干冰或-80℃冰箱中，并保证在实验前始终处于-70℃以下，以避免经修饰的蛋白以及低丰度表达的蛋白的降解。

（5）分装原则

为避免样本冻融，建议收集样本的时候对样本进行分装备份，从而保证数据质量的可靠性，检测结果的准确性。

4. 取样要求

（1）样本量要求

*此处外泌体来源的原始样本量指仅从原始样本中分离外泌体直接进行组学检测的样本量要求，不含外泌体鉴定所需的原始样本量。如需从原始样本中分离外泌体后同时进行外泌体鉴定和组学检测，请联系业务完整的样本量要求表。

（2）本地样本预处理与保存建议

5. 样本包装注意事项

（1）在包裹样本的铝箔或冷冻保存管表面，用油性记号笔标明样本编号及样本类型。并且请勿与乙醇等有机溶剂接触。

（2）请勿用纱布、纸张直接包裹样本，而是用铝箔或冷冻保存管包裹后再装入样本袋中。

（3）请勿用玻璃容器在液氮中保存样本；样本包装中请勿使用透明胶带。

（4）请勿把标签纸或其他纸制的说明性文件放入样本袋内，因为纸张在液氮中是易碎的。

（5）标签纸应该贴于样本袋绳上，请勿贴于容器表面以免脱落造成样本混乱。

（6）请勿在一只样本袋中放过多的样本，以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出。样本袋在使用前先在液氮中预冷。

（7）在填写《样本登记单》时应当详细描述（临床样本则最好也注明临床病因及所处阶段）样本的类型、处理方法、储存条件以及储存时间等相关细节，以便技术人员确定合理的实验方案。

6. 样本储存注意事项

（1）细胞样本收集好后，立即放入-80℃保存。

（2）组织样本采集后，样本迅速放入进口高质量冻存管中，拧紧后立即放入液氮。然后再转移到-80℃中保存。

（3）组织样本储存于液氮或-80℃冰箱中。对于液氮保存样本，务必注意，不要用Eppendorf管和国产冻存管，因为这些管子从液氮中取出时极易发生管子爆裂而造成样本损失。

7. 样本运输注意事项

（1）飞机运输干冰上限约为2公斤，超过2公斤原则上不能运输。火车运输不受限制。

（2）干冰运输应采用壁厚且质量完好的泡沫箱，材料用编号后的冻存管存放，用塑料袋包装后埋入干冰中，泡沫箱应扣严并用封箱带封严。外套纸壳箱包装，以免碰裂。并标明轻取轻放提示，以保证安全运输。

（3）运输时可在干冰上再放一排液体冰袋。

（4）如委托快递运输，运输过程中应随时跟踪货物的情况，记录货单号，并保持与发出地和接收地的快递公司的联系。