蛋白翻译后修饰（Post-Translational Modification，PTM）赋予了单个蛋白质功能多样性的特性。在众多翻译后修饰中，磷酸化（Phosphorylation）修饰是最常见、最重要也是最被广泛研究的蛋白质修饰。蛋白质的磷酸化由蛋白激酶（Protein Kinase）催化，将ATP或GTPγ位的磷酸基转移到底物蛋白质的特定氨基酸位点上（主要是丝氨酸Ser、苏氨酸Thr和酪氨酸Tyr）。

磷酸化修饰是可逆的，去磷酸化由蛋白磷酸酶（Protein Phosphatase）催化。蛋白质磷酸化状态影响蛋白功能的激活或抑制，磷酸化修饰调节参与细胞内几乎所有的生物学过程，在调控细胞增殖、分化、发育、凋亡中发挥重要作用。生理活动以及疾病发生发展过程中都伴随着磷酸化的调控。因此，研究蛋白质的磷酸化修饰状态对生理病理研究中有着重要意义。

4D是指在传统3D保留时间（retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity）这三个维度分离基础之上增加了第四维离子淌度（mobility）的分离，重新定义了蛋白质组学的分析标准。4D Label free/4D-DIA磷酸化蛋白质组学使用布鲁克公司（Bruker）TimsTOF Pro系列质谱仪。该仪器基于双Tims以及DDA-PASEF（4D Label free磷酸化蛋白质组学）或DIA-PASEF（4D-DIA磷酸化蛋白质组学）的数据采集模式，具有更高的采集速度、灵敏度和特异性，使临床磷酸化蛋白质组学在鉴定准度、鉴定深度、定量准确性、检测周期等性能上全面提升。

适用于磷酸化蛋白质组学特征分析、高深度磷酸化修饰检测、信号通路/调控通路研究、疾病作用机制、激酶或磷酸化底物发现等研究。

磷酸化蛋白质组学项目流程包括样本准备、实验室样本制备（含蛋白质抽提、酶解成肽段、磷酸化肽段特异性富集）、上机检测、数据预处理、生信挖掘等5大环节。其中4Dlabel free和4D-DIA磷酸化蛋白质组学的上机检测模式存在区别，分别为DDA和DIA检测模式。

1. 更高的鉴定深度：相较传统3D label free磷酸化蛋白质组学技术，4D磷酸化位点检出数量更高，能满足高深度磷酸化检测需求

2. 更高的准确度：离子淌度能够有效区分修饰位点定位相近的同分异构多肽，比传统3D label free技术鉴定结果更可靠、准确

磷酸化蛋白质组技术存在不同技术路线，每种技术有其技术优势，可根据样本数量以及对数据质量的要求进行综合选择。各类技术特点如下。

1. 丰富的样本处理经验，支持各类科研需求；

2. 严格的质量标准，优秀的技术检测能力；

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吉凯基因一直致力于提供专业的蛋白质组学服务，基于蛋白质组学数据挖掘需求以及对高水平文章的生信分析内容的分析，吉凯基因蛋白质组学报告提供20多项标准分析，远超行业常规交付标准，助力广大科研用户数据挖掘轻松又高效！

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3.  提供关键蛋白质候选列表：让临床科研更轻松、高效。

关键磷酸化蛋白质候选列表（表头示例）

4.  多种GO/KEGG富集分析结果呈现方式

5.  交互式蛋白质互作PPI：支持个性化排版，悬浮显示蛋白质的多项特征信息

6. 磷酸化保守基序（motif）分析：挖掘磷酸化位点共性，为上游激酶预测和磷酸化机制研究提供支持

motif logo图

7. 蛋白质动态分布范围图：展示蛋白含量高低，高低丰度一清二楚

蛋白质动态分布范围图

8. 多组比较提供韦恩分析：展示多比较组的共有和特有差异蛋白质

4D label free磷酸化蛋白质组学应用案例

期刊: ACS Applied Materials & Interfaces

影响因子:10.383

发表单位：普渡大学

发表时间: 2021年1月

一、研究背景

细胞外囊泡(EV)具有磷脂双层结构，在唾液、尿液和血浆等体液中普遍存在。它们携带着有价值的信息，在细胞间通讯、发病机制和应激反应中发挥重要作用。近年来，人们对其在多种疾病，特别是癌症和神经退行性疾病的诊断和治疗中的应用前景进行了多方面的探究，且已经取得了重大进展。对细胞外囊泡的研究需要高效的分离方法，而传统技术如超速离心、密度梯度离心、免疫亲和法等均存在耗时长、成本高、回收效率差、纯度低等缺点，迫切需要新的、高效的分离方法，以加速细胞外囊泡的研究。

二、研究结果

1. 新的双功能磁珠法（BiMB）能更高效地分离细胞外囊泡

研究人员开发出一种新型的细胞外囊泡分离磁珠：双功能磁珠BiMB，并比较了新磁珠和仅Ti(IV)固定的磁珠（TiMB）及仅用DSPE固定的磁珠（DspeMB）之间的分离效率。透射电镜、纳米粒子跟踪分析技术（NTA）和WB等细胞外囊泡鉴定技术的结果表明，BiBM法分离获得的细胞外囊泡具有完整膜结构，平均粒径为125.7nm，且膜上表达CD9、CD63蛋白。与传统超速离心法（UC）比较发现，BiMB方法有最高的分离效率，CD9表达强度分别为：BiMB(81%) > TiMB(69%) > DspeMB(61%) > UC (30%)。TiMB和DspeMB都是基于化学亲和原理捕获细胞外囊泡，相较UC法具有更高的分离效率，而新方法BiMB可进一步提高分离效率。

2. 4D蛋白质组学结果显示BiBM有更好的性能

进一步，研究者使用4D质谱技术对不同分离方法获得的尿液细胞外囊泡进行蛋白质组学检测。BiBM分离的细胞外囊肿检测到了最多的肽段（36262个）和蛋白质（3302个）。将这些蛋白质与ExoCarta上发表的前100种外泌体蛋白质标志物进行比较发现，有95种重合蛋白，为4种方法中与数据库重合数量最高的。后续对13种外泌体蛋白标志物和3种尿液特异标志物进行定量分析，基于磁珠分离方法的结果均有更高的信号强度，显著优于UC法。

3. 4D磷酸化蛋白质组学检测及发现不同位点磷酸化的同分异构体肽段

紧接着，研究者使用4D磷酸化蛋白质组学技术对利用BiBM法从前列腺癌患者和健康对照尿液样本中分离出的细胞外囊泡进行检测（每组10人，且尿液混为一个样本，重复检测3次）。前列腺癌组和健康对照组分别鉴定到6823和6726个磷酸化肽段，分别来自1564和1413个蛋白质。前列腺癌组和健康对照组相比，得到121个上调磷酸化蛋白，103个下调磷酸化蛋白。上调磷酸化蛋白富集富集在信号转导、蛋白质磷酸化等相关GO-生物过程条目、膜结合细胞器和细胞外区域等GO-细胞组分条目，以及和蛋白激酶活性有关的GO-分子功能条目。KEGG通路富集分析表明，这些磷酸化蛋白主要参与癌症中的蛋白多糖、PI3K-Akt/AMPK信号通路和前列腺癌通路等。

最后，研究者利用4D质谱仪可以根据离子淌度维度区分不同位点磷酸化的同分异构体肽段的性能，发现了263个潜在的磷酸化同分异构体肽段，来自63个上调磷酸化蛋白。其中176个异构体与癌症相关，17个与前列腺癌相关。研究者举例展示了在前列腺癌组中的两个不同位点磷酸化的同分异构体肽段：SLsDSESDDSK和sLSDSESDDSK。它们来自蛋白CBX3，有相同的质荷比、保留时间和氨基酸序列，仅磷酸化的氨基酸位置不同。这两个同分异构体因其离子淌度的CCS值（碰撞横截面积）有微小差异，最终被4D质谱仪区分和检测。研究者强调，4D质谱仪这种能够通过离子淌度区分同分异构体的能力能帮助研究者获得关于癌症相关磷酸化位点甚至它们的相对丰度的更准确的信息。由于检测离子淌度提供了具体的CCS值这种多一维度的信息，它可能使PTM（蛋白翻译后修饰）分析得到更广泛的应用。

三、研究总结

研究者开发一种高效、特异的从体液类样本中分类细胞外囊泡的方法——双功能磁珠法（BiMB）。通过对多种分离方法的细胞外囊泡捕获效率、纯度、蛋白质组学结果（4D质谱仪检测）的评估，研究者发现，BiMB相较于仅用Ti(IV)固定的磁珠法（TiMB）及仅用DSPE固定的磁珠法（DspeMB）及超速离心法（UC）有最优的性能。研究者随后对利用BiMB法分离的前列腺癌患者和健康对照个体尿液样本的细胞外囊泡进行4D磷酸化蛋白质组学检测，并分析了差异变化的磷酸化蛋白及富集到的GO功能和KEGG通路。最后，研究者根据4D质谱仪利用第四维度离子淌度区分同分异构体肽段的性能，在前列腺癌组中分析得到了176个不同位点磷酸化的同分异构肽段，这将为蛋白翻译后修饰的研究提供新的信息，可能拓展其更宽广的应用。

DIA磷酸化蛋白质组学应用案例

期刊: Nature Communications

影响因子:17.694

发表单位:德国马克斯·普朗克生物化学研究所

发表时间: 2021年10月

一、研究背景

肿瘤坏死因子(TNF)是少数可以进行靶向治疗炎症性疾病的细胞因子之一。然而，靶向TNF的靶向治疗可能会引起显著的副作用。更系统性地认识TNF功能及信号通路将为开发更有针对性的治疗提供基础。蛋白组学领军人物之一Matthias Mann教授团队利用DIA磷酸化蛋白质组学技术解析了TNF介导的大量磷酸化事件，并利用DIA蛋白质组学和DIA磷酸化蛋白质组学揭示了CDK在TNF信号通路中的重要作用。

二、研究结果

1．DIA磷酸化蛋白质组学揭示TNF处理不同时间诱导的磷酸化事件

为了系统性揭示TNF下游磷酸化事件及动力学图景，研究者用TNF处理髓系细胞系U937，时间为15秒到1小时(处理组和非处理组各10个时间梯度，共20组，生物学重复n=6)，并进行DIA磷酸化蛋白组学检测。共检测到超过60000个磷酸化肽段，其中28000个肽段有高重复性（高可信）。TNF诱导的磷酸位点在15min达到峰值，但在处理3min后检测到显著的上调，且在60min时恢复到基线水平。许多这些瞬时磷酸化修饰蛋白参与了NF-κB和模式识别信号传导，一小簇转录相关蛋白的磷酸化位点在TNF刺激后60min仍然保持上调。

在TNF刺激的5min内，参与囊泡融合和髓系细胞分化调控的蛋白的磷酸化状态增加，而涉及RIG-I、NF-κB、TRIF和MYD88通路以及GTPase激活的条目则出现在15min之后。与转录相关的条目在整个时间过程中都受到调控，且在最近的时间点最为强烈，这与转录是TNF信号级联的最下游过程相一致。Motif富集分析显示了不同激酶沿时间过程的动态激活。CDK1/2和PLK1/3的磷酸化motif表达下调，而IKBKB(IKK2)和PRKAA1/2磷酸化motif在早期时间点表达上调。

研究者同时对其他细胞系在TNF处理15min后的磷酸化事件进行检测，这些细胞系包括A549（腺癌肺泡基底上皮细胞系）、HT29（结直肠腺癌细胞系）和U2OS（骨肉瘤细胞系）和小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)。许多在TNF处理下显著调控的磷酸化事件在不同的人类细胞系中是共享的。

2. 抑制激酶揭示了TNF刺激下激酶-底物的关系

由于在TNF刺激下许多下游激酶的同时激活，对特定的激酶-底物关系的识别仍然具有挑战性。为了解决这个问题，研究者使用特定的抑制剂靶向关键激酶对细胞进行处理，并进行DIA磷酸化蛋白组学检测（TNF处理与否（2组）和激酶抑制剂±TNF处理（10组），共12组，生物学重复n=4）。虽然单独TNF就诱导了数百个磷酸化事件的调控，但抑制TAK1几乎完全消除了这种作用。这证实了TAK1在TNF信号通路上游的作用。

相比之下，抑制下游激酶如IKK1/2、p38、MEK1/2和JNK对TNF调控的磷酸化位点有些微到中等的影响。抑制p38的影响最强，降低了76%的TNF上调的磷酸化位点。在STRING蛋白相互作用网络中，TNF刺激下与其他磷酸化蛋白不相关的蛋白可以被划为上游激酶。

3. 亚细胞组分的DIA蛋白组学和DIA磷酸化蛋白组学揭示TNF介导的磷酸化诱导了广泛的蛋白质易位

研究者从有无TAK1抑制剂的TNF处理15min的细胞中分离细胞膜、细胞核和细胞质，并进行了这些亚细胞组分的DIA蛋白质组学和DIA磷酸化蛋白质组检测（未处理组、TNF处理和TNF+TAK1i处理组，各3种亚细胞组分，共9组，生物学重复均为n=4）。

在TNF刺激下，NF-κB必需调节因子(NEMO或IKBKG)、TRAF2和TNIP1水平在细胞膜中升高。其他一些蛋白质也易位到细胞膜部分。一些蛋白质在TNF处理后从细胞膜中脱离出来。在TNF刺激的15min内，触发了许多参与转录的蛋白的核易位，表明存在转录反应。大多数激酶，包括TAK1(MAP3K7)、p38(MAPK14)、IKK2(IKBKB)和MEK1/2(MAP2K1/2)，主要富集于细胞质中，而不依赖于TNF的刺激。然而，TNF调控的这些激酶下游蛋白上的磷酸化位点在所有的细胞亚组分中都有富集。其中大部分依赖于定位在细胞质中的TAK1的活性，这意味着TNF触发了激酶及其底物的蛋白易位。研究者甚至检测到了蛋白质组学中未检测到的肽段上的TNF调控的磷酸化事件。这表明这些底物的磷酸化作用触发了易位，或者在易位时，蛋白质立即被磷酸化。

4．TNF诱导的细胞死亡触发了强烈的RNA加工反应和CDK激活

通过靶向TAK1和IKK2来抑制NF-κB信号通路，可诱导TNF下游的细胞死亡。这种细胞死亡可以是凋亡也可以是坏死。为了探索磷酸化事件调节细胞死亡的作用，研究者用TNF处理3h或与cIAP抑制剂Smac mimetic（SM）联用诱导U937细胞凋亡，或与Smac mimetic（SM）和caspase抑制剂Idun(IDN-6556)诱导细胞坏死，并进行DIA蛋白质组学和DIA磷酸化蛋白质组学检测（未处理组、TNF处理组、TNF+SM组和TM+SM+IDN-6556组，共4组，每组生物学重复均为n=4）。研究者还在BMDM细胞中进行了实验。研究者发现细胞凋亡过程中，两种细胞类型中参与RNA剪接和mRNA加工的蛋白质上的磷酸位点显著上调（U937细胞中344个磷酸位点，BMDMs中123个磷酸位点）。刺激诱导的磷酸化蛋白质组变化与蛋白质组的变化无关。磷酸化的激酶富集分析显示了细胞凋亡过程中周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）的调控。对刺激后CDKs上显著变化的磷酸位点进行分析，发现是转录性的CDKs(CDK7、9、12、13和14)受到调控，而不是参与了细胞周期调控的CDKs。后续实验表明TNF信号通路诱导细胞磷酸化，从而诱导CDK9和CDK12/13介导的RPB1的激活。

5. CDK激酶的活性是TNF靶基因转录所必需的

TNF通过诱导广泛的靶基因触发强大的转录反应。其促炎特性主要是通过上调细胞因子来调节免疫反应，而促存活基因的上调则可以防止细胞过度死亡和炎症。研究者的数据表明，RPB1磷酸化受到调控，由于该蛋白是TNF介导的转录所必需的，研究者想知道抑制转录性的CDKs是否会影响TNF诱导的靶基因表达。

CDK抑制剂处理的细胞的磷酸化蛋白质组学（TNF处理与否（共2组）和TNF±各CDK抑制剂组（共6组），共8组，每组生物学重复n=4）显示，TNF诱导的CDK12/13磷酸化以及早期和晚期的RNA加工受到抑制。有趣的是，对TNF处理的U937细胞的蛋白质组学分析显示，Dinaciclib（CDK1/2/5抑制剂）或两种CDK12抑制剂CDK12-in345和THZ531几乎完全消除了蛋白调控。这些CDK抑制剂也不同程度降低了经典靶基因ICAM1和SOD2的上调。CDK抑制消除了XIAP的轻微下调，这表明这种调控依赖于转录。NF-κB信号通路作为驱动TNF诱导转录的主要途径则不受影响。为了验证CDK抑制剂确实在转录水平上抑制了靶基因的表达，研究者检测了它们对TNF介导的CCL2(MCP1)和CXCL10(IP10)mRNA水平上调的影响，这些基因的mRNA水平确实降低了。同样，加入CDK抑制剂后，小鼠骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)释放的细胞因子IP10较少。这与之前研究CDK9作用的研究一致，这表明抑制转录性的CDKs9、12和13可能在疾病中具有抗炎作用。

6. 转录性CDKs可抑制TNF诱导的细胞死亡

研究者进一步想知道通过转录性CDK抑制剂抑制TNF介导的FLIP上调是否会增强TNF诱导的细胞死亡。用泛CDK抑制剂或其他不同CDK抑制剂处理细胞，均与TNF、TNF +Smac mimetic (SM)或SM +IDN-6556联合一样触发协同细胞死亡。靶向不参与转录的CDKs的抑制剂未能诱导协同细胞死亡。这些实验表明，转录性的，而不是非转录性的CDKs加剧了TNF诱导的细胞死亡。

为了检测CDK抑制剂是否也增强了TNF依赖的坏死，研究者使用SM和caspase抑制剂IDN-655652联合处理U937细胞。在野生型U937细胞中，CDK抑制也增强了CDK12/13的坏死，而缺乏坏死介导因子MLKL和RIPK3的细胞未能死亡。协同诱导细胞凋亡并不局限于U937细胞，也存在于A549细胞、HT29细胞、U2OS细胞、小鼠皮肤成纤维细胞(MDFs)和小鼠BMDMs中。仅使用TNF并不足以诱导这些细胞的协同死亡，这表明抑制CDK只能增强而不能触发细胞死亡。研究者的结论是，TNF介导的转录性的CDKs调控导致其底物的磷酸化和调控，包括RPB1的CTD。这个最大的RNA聚合酶II亚基对于FLIP等促存活蛋白的转录是必需的，其磷酸化对于防止细胞凋亡和坏死是必要的。不同细胞系中的细胞死亡数据表明，CDK抑制剂加重细胞死亡取决于它们对TNF介导的细胞凋亡和坏死的敏感性。

三、研究总结

本研究通过DIA磷酸化蛋白质组学深入分析了TNF刺激不同时间后诱导的下游磷酸化信号事件。通过亚细胞组分的DIA蛋白质组学和DIA磷酸化蛋白质组学揭示了磷酸化依赖性的蛋白质易位。对TNF诱导凋亡和坏死细胞的DIA磷酸化蛋白质组分析揭示了转录周期蛋白依赖性激酶（CDK）活性在促进细胞因子产生和防止TNF信号受体下游的细胞过度死亡方面的关键作用。

1. 样本寄送流程

注意：所有样本均应标明准确的样本编号，同时配有一张样本登记表，写明样本名称、物种、编号、取样日期、样本处理情况等。

2. 样本寄送地址

上海市浦东新区张江高科爱迪生路332号仓库。

3. 取样原则

（1）代表性原则

取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义，因此您应该根据实验目的慎重选择您的取样方案。

病变组织样本中应不夹带正常组织，正常组织样本中不能含有病变组织。有条件时，应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致，否则可能会影响实验结果的可信度。

（2）准确性原则

代表性样本的各种特征数据必须被准确记录，并按要求（低温、迅速）采集、制备、贮存、运输，最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。

（3）迅速性原则

样本质量是蛋白质组学实验中影响实验结果的最关键因素，因此用于蛋白质组研究的样本，在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速，最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。

（4）低温原则

所取样本离体后，应尽快置于液氮（首选）、干冰或-80℃冰箱中，并保证在实验前始终处于-70℃以下，以避免经修饰的蛋白以及低丰度表达的蛋白的降解。

（5）分装原则

为避免样本冻融，建议收集样本的时候对样本进行分装备份，从而保证数据质量的可靠性，检测结果的准确性。

4. 取样要求

（1）样本量要求

*此处外泌体来源的原始样本量指仅从原始样本中分离外泌体直接进行组学检测的样本量要求，不含外泌体鉴定所需的原始样本量。如需从原始样本中分离外泌体后同时进行外泌体鉴定和组学检测，请联系业务完整的样本量要求表。

（2）本地样本预处理与保存建议

5. 样本包装注意事项

（1）在包裹样本的铝箔或冷冻保存管表面，用油性记号笔标明样本编号及样本类型。并且请勿与乙醇等有机溶剂接触。

（2）请勿用纱布、纸张直接包裹样本，而是用铝箔或冷冻保存管包裹后再装入样本袋中。

（3）请勿用玻璃容器在液氮中保存样本；样本包装中请勿使用透明胶带。

（4）请勿把标签纸或其他纸制的说明性文件放入样本袋内，因为纸张在液氮中是易碎的。

（5）标签纸应该贴于样本袋绳上，请勿贴于容器表面以免脱落造成样本混乱。

（6）请勿在一只样本袋中放过多的样本，以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出。样本袋在使用前先在液氮中预冷。

（7）在填写《样本登记单》时应当详细描述（临床样本则最好也注明临床病因及所处阶段）样本的类型、处理方法、储存条件以及储存时间等相关细节，以便技术人员确定合理的实验方案。

6. 样本储存注意事项

（1）细胞样本收集好后，立即放入-80℃保存。

（2）组织样本采集后，样本迅速放入进口高质量冻存管中，拧紧后立即放入液氮。然后再转移到-80℃中保存。

（3）组织样本储存于液氮或-80℃冰箱中。对于液氮保存样本，务必注意，不要用Eppendorf管和国产冻存管，因为这些管子从液氮中取出时极易发生管子爆裂而造成样本损失。

7. 样本运输注意事项

（1）飞机运输干冰上限约为2公斤，超过2公斤原则上不能运输。火车运输不受限制。

（2）干冰运输应采用壁厚且质量完好的泡沫箱，材料用编号后的冻存管存放，用塑料袋包装后埋入干冰中，泡沫箱应扣严并用封箱带封严。外套纸壳箱包装，以免碰裂。并标明轻取轻放提示，以保证安全运输。

（3）运输时可在干冰上再放一排液体冰袋。

（4）如委托快递运输，运输过程中应随时跟踪货物的情况，记录货单号，并保持与发出地和接收地的快递公司的联系。