外泌体(Exosome)是一种具有脂质双层膜结构，包含在由多个核内体与质膜融合形成的多泡小体中的内源形成的囊泡。 由细胞质中产生，经细胞膜释放，大多数直径在30-150nm之间；携带有母细胞的多种蛋白质、脂类、DNA和RNA( lncRNA/circRNA/smallRNA)，存在于血液/尿液/乳汁/唾液/精浆等液体中及细胞培养上清液中。
miRNA是一类大小约20-25个碱基的单链小RNA，miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻译，从而在转录后水平调控蛋白表达。细胞外游离miRNA通常以蛋白复合物或者外泌体的形式存在于真核生物血液、尿液、唾液、脑脊液等体液中。其中所含miRNA的表达水平与来源细胞有明显不同，并且随生理条件的不同而变化，因而细胞外游离或外泌体miRNA具有作为液体活检分子标志物的潜力。
Size：30-100nm
Gene Ontology（简称GO）是一个国际标准化的基因功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表（controlled vocabulary）来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。GO总共有三个ontology（本体），分别描述基因的分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cellular component，CC）、参与的生物过程（biological process，BP）。
Pathway的分析有助于更进一步了解基因的生物学功能。KEGG是有关Pathway的主要公共数据库。Pathway显著性富集分析以KEGG Pathway为单位，应用超假设检验，找出与整个基因组背景相比，在基因中显著性富集的Pathway。通过Pathway显著性富集能确定基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。以Benjamini-Hochberg法（BH）计算adjust p value（即padj）。
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外泌体miRNA-seq转录组测序 |
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总RNA |
总量≥20ng（一次建库），浓度≥50ng/μl（Qubit的检测浓度，不是NanoDrop的检测浓度），2100检测25-200nt范围内有峰 |
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细胞上清 |
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血清血浆 |
(1)用采血针和EDTA抗凝管抽取全血，轻柔上下颠倒混匀后室温或者4°C保存，并在1小时内进行下一步处理；
(2) 4°C条件下，使用吊桶式转头1900g离心10min，小心吸取上清即为血浆，最后500μl左右丢弃。得到的血浆再次离心，条件为4°C，3000g，15min，小心吸出血浆，注意不要碰到底部和侧面的沉淀物；
提示：有条件最好提供4ml以上（分离4ml血浆约需要8-10ml全血），不能用肝素抗凝采血管。
(2)室温静置30min，然后4°C条件下，静置3-4小时（此时可见血块析出）；
(3)用移液器吸取上面的淡黄色血清（应该有4ml左右）转入离心管中，4°C条件下3000g离心15min，小心取上清转入新的离心管中，最大程度保证血清质量；
(4)离心后的血清15分钟内冻存于-80°C冰箱，干冰寄送；
提示：有条件最好提供5 ml以上（分离5 ml血清约需要10-15ml全血），尽量采用血浆，避免血清凝集过程中血小板来源的外泌体影响。
(1)细胞在正常含有血清的培养基中培养一定时间，贴壁细胞密度在70%-80%，悬浮细胞密度在60%-70%；
(2)对于贴壁细胞，去除原有培养基，换为新的不含外泌体的培养基或者无血清培养基；对于悬浮细胞，300g，4°C，10min收集细胞；
(3)使用不含外泌体的培养基或者无血清培养基悬浮细胞并继续培养。细胞继续培养24-48小时，根据细胞的生长速度确定收取上清时间；
(4)收集细胞上清，300g，4°C，离心10min；小心吸取上清，注意避免吸入细胞或者细胞碎片；
(5) 3000g，4°C，再次离心15min，确保将细胞或者细胞碎片去除干净；
(6)取上清，注意避免吸入细胞或者细胞碎片，合并相同的细胞培养液上清样品，装入无菌的玻璃瓶，可在4°C短期保存（1-2天），长期保存可冻存于-80°C，干冰寄送。
提示：需采用去除外泌体的培养基，建议细胞上清分离后尽快进行外泌体分离。
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