传统miRNA-seq定量分析过程中，由于建库过程中PCR对片段长度和GC碱基含量的偏好会导致部分文库片段丰度失真，进而对定量结果产生影响。UMI(Unique Molecular Identifier)分子标记则通过随机性利用不同的分子标签，标记和区分不同的分子。绝对定量转录组测序(UMI-seq)通过在文库扩增前为每一条逆转录的cDNA添加唯一的分子标签UMI，使同一个片段扩增出来的产物均带有相同的标签，天然重复段则带有不同的标签。利用UMI过滤数据，可一比一准确还原样本初始状态。

被唯一的随机分子标签标记的cDNA分子，在PCR、测序及后续分析过程中都携带着这个独特的UMI标签。通过计数UMI的个数，可实现原始RNA分子的“绝对定量”。

1、可区分天然重复与扩增重复，准确识别可变剪切事件；

2、建库起始量低，200ng的Total RNA就能顺利进行mRNA/small RNAseq，更适合量少珍贵样品;

3、基因表达水平精准定量，避免低丰度基因丢失，可为致病及易感基因筛选等提供精准分析；

4、差异基因与Q-PCR验证一致性更高,极大缩短实验目标筛选时间。据文献报道，普通RNA-seq和miRNA-seq与Q-PCR验证的相关性为70%和35%，使用UMI建库，相关性可以达到80%以上。

1、比较转录组：要求精准的序列信息，从表达水平反应转录组进化的动态变化，并寻找潜在的驱动基因变化

2、个体机制：要求准确的mRNA、smallRNA差异基因分析，构建miRNA及其靶基因的相关调控网络

3、互作转录组：寄生类RNA表达丰度较低，可通过增加PCR循环次数提高检出率同时保证准确性

4、生物标志物：适用于起始量较低或者富集较困难样本

研究目的：通过UMI转录组提高RNA-Seq准确性和可重复性

样本信息：处于不同甲状腺机能状态下的小鼠肝脏

测序策略：UMI-smallRNAseq+UMI-mRNA-seq

结论：通过对大肠杆菌mRNA、人胃miRNA构建两种不同文库，对其实际定量与模拟定量进行Fold-change计算。实验数据表明，使用UMI的文库定量与理论值相关性和稳定性明显高于普通建库方式，尤其是在低拷贝区域，展现出明显优势。

sRNA长度筛选

对各样品的clean reads，筛选一定长度范围内的sRNA来进行后续分析。一般来说，动物sRNA的长度区间为18~35nt，植物sRNA的长度区间为18~30nt，sRNA长度分布的峰图可以帮助我们判断sRNA的种类，如miRNA集中在21~22nt，siRNA集中在24nt等。

miRNA表达水平分析

差异miRNA靶基因GO富集分析

有向无环图（Directed Acyclic Graph，DAG）为候选靶基因GO富集分析结果的图形化展示方式，分支代表包含关系，从上至下所定义的功能范围越来越小，一般选取GO富集分析的结果前10位作为有向无环图的主节点，并通过包含关系，将相关联的GO Term一起展示，颜色的深浅代表富集程度。我们的项目中分别绘制生物过程（biological process）、分子功能（molecular function）和细胞组分（cellular component）的候选靶基因DAG图。

差异miRNA靶基因KEGG富集分析

候选靶基因KEGG富集散点图是KEGG富集分析结果的图形化展示方式。在此图中，KEGG富集程度通过Rich factor、Qvalue和富集到此通路上的基因个数来衡量。我们挑选了富集前20位的pathway条目在该图中进行展示，若富集的pathway条目不足20条，则全部展示。

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