4D蛋白质组学在传统3D保留时间（retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity）这三个维度分离基础之上增加了第四维离子淌度（mobility）的分离，重新定义了蛋白质组学的分析标准。4D Label free建立在TimsTOF Pro上，基于双Tims和PASEF的数据采集模式，具有更高的采集速度、灵敏度和特异性，使临床蛋白质组学在鉴定准度、鉴定深度、定量准确性、检测周期等性能上全面提升。
适用于小规模样本的机制研究
4D项目流程包括样本准备、实验室样本制备、上机检测、数据预处理、生信挖掘等5大环节。
1. 更高的鉴定深度：助力更多肽段和蛋白的鉴定，蛋白鉴定数提高50~100%
2. 更适合微量样本：比常规TMT技术要求的送样量少50%~80%，能够满足临床珍贵、微量样本的蛋白组分析需求
| 样本类型 | 送样量 | |
| 4D label free | TMT | |
| 细胞 | 1.25E+6 个 | 5E+6 个 |
| 组织 | 7.5 mg | 30 mg |
| 血清/血浆 | 25 ul | 100 ul |
3. 更高的准确度：离子淌度能够有效区分共洗脱肽段/同分异构体肽，比传统label free技术鉴定结果更可靠、准确
1.丰富的样本处理能力，支持各类科研需求；
2.严格的质量标准，领先的技术检测能力，达到国际顶尖实验室水平；
3.追求极致的报告体验，提供三套差异筛选标准结果，报告解读、数据挖掘视频及中英文方法说明等应有尽有，详情点结果示例；
4.专业的售前售后服务，及时响应客户消息，100%解决问题。
吉凯基因一直致力于提供专业的蛋白质组学服务，基于蛋白质组学数据挖掘需求以及对高水平文章的生信分析内容的分析，吉凯基因蛋白质组学报告提供20多项标准分析，远超行业常规交付标准，助力广大科研用户数据挖掘轻松又高效！
详情可点击往期报道：
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2023新品系列！吉凯蛋白质组学报告再更新，6大亮点助力临床科研更省心、更省力、更高效
1. 多种样本平行性及质量评价维度：从源头上把控数据质量，以提高分析结论的可靠性、可重复性
2. 三套差异筛选标准：让每套数据找到最适合的标准
|
group |
P≤0.05 & FC上下调倍数 |
上调蛋白质个数（UP） |
下调蛋白质个数（DOWN） |
总差异蛋白质个数（ALL） |
|
A VS B |
1.2 |
224 |
184 |
408 |
|
A VS B |
1.5 |
77 |
63 |
140 |
|
A VS B |
2 |
22 |
14 |
36 |
三套差异筛选结果一览表（示例）
3. 提供关键蛋白质候选列表：让临床科研更轻松、高效。
| Pretein ID | GeneName | FC | p-value | Regulation |
| 蛋白质的Uniprot ID号 | 基因名称 | 差异表达变化倍数 | t-test量著性p值 | 上调或下调 |
| GO-BP | Go-CC | GO-MF | KEGG | GSEA-GO |
| 归属到的显著性富集GO-BP条目(名称&数量) | 归属到的显著性富集GO-CC条目(名称&数量) | 归属到的显著性富集GO-MF条目(名称&数量) | 归属到的显著性富集KEGG条目(名称&数量) | 归属到的显著性富集GSEA-GO条目(名称&数量) |
| GSEA-KEGG | PPI degree | Transcription factor | Kinase | Cancer pathway related |
| 归属到的显著性富集GSEA-KEGG条目(名称&数量) | 在PPI分析中与其他蛋白连接的节点数 | 是否属于转录因子 | 是否属于激酶 | 是否属于肿瘤通路相关蛋白 |
| Pubmed文献数 | PRM预实验评估结果 | |||
| 在Pubmed中检索到的文献数 | 是否通过PRM预实验评估 |
关键蛋白质候选列表（表头示例）
4. 多种GO/KEGG富集分析方法：多角度分析，让“烂”的数据也能挖出结果
（1）基于差异蛋白质的传统富集分析方法（Fisher’s Exact Test）
（2）不依赖于差异蛋白质的GO/KEGG富集分析（GSEA分析）
5. 交互式蛋白质互作PPI：支持个性化排版，悬浮显示蛋白质的多项特征信息
6. 蛋白质动态分布范围图：展示蛋白含量高低，高低丰度一清二楚
7. 多组比较提供韦恩分析：展示多比较组的共有和特有差异蛋白质
期刊: Cell Death & Disease
影响因子:9.685
发表单位：武汉大学人民医院神经外科
发表时间: 2022年4月
一、研究背景
Claudin蛋白家族通常位于细胞膜的顶端区域，能够形成紧密连接（TJs）复合物，用于维持细胞间粘附、维持细胞极性和选择性细胞旁通透性。Claudins蛋白家族成员的过度表达或缺乏表达在慢性炎症和恶性肿瘤等疾病的病理过程中起着关键作用，其中Claudin-4（CLDN4）是Claudin家族的重要成员。
有研究表明，胃癌中的CLDN4可增强胃癌细胞的增殖，侵袭和上皮-间质转化（EMT），并被miR-596和miR-3620-3p逆转。同样，CLDN4的过表达后，可通过PI3K/Akt和EMT转录因子Twist1信号通路，诱导卵巢癌细胞EMT。然而，CLDN4在恶性胶质瘤（GBM）中的生物学作用仍然未知。
二、研究结果
1. CLDN4在胶质瘤组织和细胞中高表达
CLDN4在癌症基因组图谱（TCGA）高级别胶质瘤中高表达。Kaplan–Meier分析表明，CLDN4的表达与OS和DFS呈负相关。在我们的研究中，CLDN4在恶性胶质瘤（GBM）组织中的表达高于邻近正常组织。与低级别胶质瘤脑组织相比，GBM患者中CLDN4的表达最高。与正常人星形胶质细胞系（NHA）相比，GBM细胞系中CLDN4的表达显著增加。这些结果表明CLDN4在胶质瘤中表达增加，与预后呈负相关。
2. CLDN4过表达能够促进GBM细胞的增殖，迁移和侵袭能力
为了进一步研究CLDN4对GBM生物学行为的影响，在U87细胞和LN229细胞系中建立了沉默和过表达模型。与对照组相比，CLDN4敲低显著抑制细胞增殖，迁移和侵袭。相反，CLDN4的过表达促进了细胞的增殖，迁移和侵袭。过表达的CLDN4也显著增加了间充质相关基因的表达。这些结果表明CLDN4过表达能够促进GBM细胞的增殖，迁移和侵袭，并且对于维持GBM的间充质特性是必需的。
3.下调CLDN4后对GBM细胞进行蛋白组学分析
对TCGA数据库中544例GBM患者的测序结果进行分析表明当CLDN4表达下调时，TNF-α途径相关基因的表达显著下调。为了进一步了解CLDN4在GBM细胞中的作用，在U87MG细胞中下调CLDN4，并使用吉凯基因的4D label free技术进行蛋白组学分析。结果显示，当敲除CLDN4时，615种蛋白质被上调，467种蛋白质被下调。与CLDN4表达相关的差异表达蛋白的GO分析表明，CLDN4的下调主要与细胞粘附和TNF-α信号通路有关，这与TCGA数据库的生物信息学分析结果一致。因此，TNF-α分子通路可能是GBM中CLDN4致癌过程的潜在重要特征。
4. CLDN4可以调节TNF-α诱导的NF-κB活性
以前的研究表明，TNF-α通过激活IKK复合物来调节NF-κB信号通路。进一步的研究表明，TNF-α以时间依赖性方式增加NF-κBp65水平，能够诱导GBM细胞的间质转化，增强GBM细胞的迁移能力。CLDN4能够调节TNF-α诱导的NF-κB活性。
5. TGFβ1可促进CLDN4核积累
CLDN4 mRNA取决于TGFβ或ITD-1（ITD-1可以阻断TGFβ2诱导的P-Smad2/3）的处理，揭示了经典的TGFβ信号通路可以参与CLDN4表达的调控。研究发现TGFβ1促进CLDN4进入细胞核，而ITD-1起相反的作用。同时通过免疫荧光分析，TGFβ1和ITD-1分别逆转shCLDN4和CLDN4OE中细胞核CLDN4的表达。以上结果表明，核转位机制可能是调节CLDN4表达的主要途径。
6. 敲低CLDN4显著抑制肿瘤生长
为了进一步研究抑制CLDN4表达对体内GBM进展的抗癌作用，通过颅内注射荧光素酶标记的CLDN4 NC或shCLDN4 U87细胞建立异种移植模型，将其直接接种到裸鼠侧脑室。在异种移植后6天进行ITD-1治疗，并且每天重复三次。研究表明，shCLDN4+ITD-1组的异种移植肿瘤体积显著减少，GBM的肿瘤发展受到抑制，总生存率也高于其他组。异种移植肿瘤的Ki67染色结果显示shCLDN4+ITD-1组的Ki67阳性率显著降低，表明CLDN4敲低可抑制GBM肿瘤的进展。最后，我们提取异种移植蛋白，发现shCLDN4+ITD-1组显著抑制GBM细胞的间充质转化。因此，这些结果证明CLDN4的稳定下调抑制了异种移植小鼠胶质瘤的生长和侵袭，并且与ITD-1联合治疗可以获得更好的结果。
三、研究总结
此项研究首次发现CLDN4在GBM组织和细胞中上调。CLDN4高表达的患者总生存时间较短。CLND4表达的抑制可以在体外和体内抑制间充质转化，细胞侵袭，细胞迁移和肿瘤生长。CLDN4诱导GBM细胞间质转化是通过调节TNF-α介导的NF-κB信号通路。在另一方面，TGF-β/smad2信号通路可以调节CLDN4的表达和核转位。总之，研究结果表明TGF-β/CLDN4/TNF-α/NF-κB信号轴在胶质瘤的生物学进展中起关键作用。干扰这个信号轴的功能可能是GBM患者的一种新的治疗策略。
四、吉凯助力
该研究中的4D label free蛋白质组和慢病毒产品均由吉凯基因提供。
1. 样本寄送流程
注意：所有样本均应标明准确的样本编号，同时配有一张样本登记表，写明样本名称、物种、编号、取样日期、样本处理情况等。
2. 样本寄送地址
上海市浦东新区张江高科爱迪生路332号仓库。
3. 取样原则
（1）代表性原则
取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义，因此您应该根据实验目的慎重选择您的取样方案。
病变组织样本中应不夹带正常组织，正常组织样本中不能含有病变组织。有条件时，应做到实验组与对照组的样本在取材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致，否则可能会影响实验结果的可信度。
（2）准确性原则
代表性样本的各种特征数据必须被准确记录，并按要求（低温、迅速）采集、制备、贮存、运输，最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。
（3）迅速性原则
样本质量是蛋白质组学实验中影响实验结果的最关键因素，因此用于蛋白质组研究的样本，在采集、制备、贮存、运输过程中应尽可能地做到迅速，最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。
（4）低温原则
所取样本离体后，应尽快置于液氮（首选）、干冰或-80℃冰箱中，并保证在实验前始终处于-70℃以下，以避免经修饰的蛋白以及低丰度表达的蛋白的降解。
（5）分装原则
为避免样本冻融，建议收集样本的时候对样本进行分装备份，从而保证数据质量的可靠性，检测结果的准确性。
4. 取样要求
（1）样本量要求
|
样本大类 |
样本类型 |
4D label free送样量 |
|
细胞类 |
悬浮/贴壁细胞 |
≥1×10^6 |
|
动物 组织 |
心，肝，脾，肾，肺叶，血管等 |
≥7mg |
|
皮肤，软骨，毛发等坚硬组织 |
≥50mg |
|
|
体液类 |
血清、血浆（去高丰度蛋白，抗体亲和柱法） |
≥50μl |
|
血清、血浆（富集低丰度蛋白，纳米颗粒材料法） |
≥200μl |
|
|
血清、血浆（不去高丰度） |
≥20μl |
|
|
动物或人乳汁 |
≥500μl |
|
|
脑脊液（去高丰度蛋白） |
≥4ml |
|
|
脑脊液（不去高丰度） |
≥0.5ml |
|
|
关节液、淋巴液、附睾腔液 |
≥0.5ml |
|
|
唾液 |
≥25μl |
|
|
泪液 |
≥100μl |
|
|
尿液 |
≥4ml |
|
|
其余特殊类型样本 |
细胞上清 |
≥2.5ml |
|
石蜡样本（FFPE） |
15片（切片厚度5-10μm） |
（2）本地样本预处理与保存建议
|
样本大类 |
样品类型 |
预处理及保存 |
|
细胞类 |
悬浮细胞 |
1. 400g-1000g离心10分钟收获细胞，弃上清； 2. 用预冷的PBS小心洗涤片状沉淀物2次，置于冰上，去上清； 3. 液氮速冻，-80℃保存。 建议您以细胞沉淀的形式送样。如样本已经裂解，裂解液可能与我们的实验操作系统存在不兼容问题，我们需要进一步进行蛋白沉淀，这个过程可能会有一点蛋白的损失。 注意：PBS清洗时需要小心，避免细胞的损失！ |
|
贴壁细胞 |
1. 弃掉培养液，并将培养皿倒置于吸水纸上吸干培养液； 2. 加入4℃预冷的PBS，平放轻轻摇动1 分钟洗涤细胞，然后弃去PBS。 重复以上操作两次以洗去培养液； 3. 将培养皿置于冰上。向培养皿内加入4℃预冷的PBS。用干净的细胞刮棒将细胞刮于培养皿的一侧（动作要快），冰上斜置培养皿，使得缓冲液流向一侧。移液管吸取溶解产物至预冷的离心管内。离心去上清； 4. 液氮速冻，-80℃保存。 建议您以细胞沉淀的形式送样。如样本已经裂解，裂解液可能与我们的实验操作系统存在不兼容问题，我们需要进一步进行蛋白沉淀，这个过程可能会有一点蛋白的损失。 注意：PBS清洗时需要小心，避免细胞的损失！ |
|
|
动物组织 样本 |
心，肝，脾，肾，肺叶，血管，皮肤等 |
1.首先准备好用于包装样本冷冻保存管，并且用油性记号笔在冻存管外表多处写明样本编号； 2.准确切除所需组织后，立即剔除非研究所需的组织，并将组织分割成小块； 3.用镊子夹住样本，放入液氮中冷却样本； 4.放入准备好的冷冻保存管中，迅速投入液氮冷却，然后转入-80℃冰箱中保存； 5.填写样本登记单，写明临床病因及所处阶段，样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况。 |
|
软骨等坚硬组织 |
PBS 洗涤，用手术刀将软骨切成0.5cm3 左右的小块。液氮速冻，保存在-80℃。 |
|
|
毛发等坚韧组织 |
用适量2%SDS，50mM 磷酸钠（pH7.8）缓冲液漂洗样品，去除污染物，干燥，保存在-80℃。 |
|
|
体液类 |
血清 |
收集好的全血室温静置两小时，3000g 离心10min，取上清，液氮速冻，-80℃保存。 |
|
血浆 |
收集好的全血加入抗凝剂（可选择肝素或EDTA），室温静止30 分钟，1300g-2000g 离心10min，取上清，液氮速冻，-80℃保存。 |
|
|
动物或人乳汁 |
收集乳汁，-80℃保存。若要去除样品中的高丰度酪蛋白，需要超速离心除去。 |
|
|
脑脊液、关节液、淋巴液、附睾腔液 |
1000g-2000g 离心5min，（或使用0.22μm 滤膜过滤），取上清，-80℃保存。 |
|
|
唾液 |
禁食两小时以上，9-12am 取样，1000g-2000g 离心5min，（或使用0.22um 滤膜过滤），取上清，-80℃保存。 |
|
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泪液 |
收集样品（可利用capillary micropipette 或Schirmer strip），8000-14000g 4度 离心5min，取上清， -80℃保存。 |
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尿液 |
5000g 4°C 离心30-60min，取上清， -80℃保存。 |
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其余特殊类型样本 |
细胞上清 |
10000g-20000g 离心30-60min，（或使用0.22um 滤膜过滤），取上清，-80℃保存，注意，应为无血清培养基。 |
|
石蜡样本（FFPE） |
以石蜡块形式保存的样本进行常规切片操作（切片厚度5-10μm），不用固定在玻片上，检查样本无污染后，妥善包装，常温寄送。 |
5. 样本包装注意事项
（1）在包裹样本的铝箔或冷冻保存管表面，用油性记号笔标明样本编号及样本类型，并且请勿与乙醇等有机溶剂接触。
（2）请勿用纱布、纸张直接包裹样本，而是用铝箔或冷冻保存管包裹后再装入样本袋中。
（3）请勿用玻璃容器在液氮中保存样本；样本包装中请勿使用透明胶带。
（4）请勿把标签纸或其他纸制的说明性文件放入样本袋内，因为纸张在液氮中是易碎的。
（5）标签纸应该贴于样本袋绳上，请勿贴于容器表面以免脱落造成样本混乱。
（6）请勿在一只样本袋中放过多的样本，以防无法放入液氮罐或无法从液氮罐中取出。样本袋在使用前先在液氮中预冷。
（7）在填写《样本登记单》时应当详细描述（临床样本则最好也注明临床病因及所处阶段）样本的类型、处理方法、储存条件以及储存时间等相关细节，以便技术人员确定合理的实验方案。
6. 样本储存注意事项
（1）细胞样本收集好后，立即放入-80℃保存。
（2）组织样本采集后，样本迅速放入进口高质量冻存管中，拧紧后立即放入液氮。然后再转移到-80℃中保存。
（3）组织样本储存于液氮或-80℃冰箱中。对于液氮保存样本，务必注意，不要用Eppendorf管和国产冻存管，因为这些管子从液氮中取出时极易发生管子爆裂而造成样本损失。
7. 样本运输注意事项
（1）飞机运输干冰上限约为2公斤，超过2公斤原则上不能运输。火车运输不受限制。
（2）干冰运输应采用壁厚且质量完好的泡沫箱，材料用编号后的冻存管存放，用塑料袋包装后埋入干冰中，泡沫箱应扣严并用封箱带封严。外套纸壳箱包装，以免碰裂。并标明轻取轻放提示，以保证安全运输。
（3）运输时可在干冰上再放一排液体冰袋。
（4）如委托快递运输，运输过程中应随时跟踪货物的情况，记录货单号，并保持与发出地和接收地的快递公司的联系。
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