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敲入

利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术进行目的基因敲入细胞系的构建

技术原理

CRISPR/Cas9 对靶DNA序列进行切割后,在donor序列存在的情况下,利用细胞的同源重组修复(homology directed repair,HDR)机制将donor序列和切割处的DNA序列进行替换,从而在DNA特定位置引入外源序列,通过对CRISPR/Cas9 和donor质粒转染的细胞进行单克隆分离培养后测序,可以筛选出目的序列有效敲入的单克隆细胞株进行后续科研实验。


实现HDR需要同时向细胞内转入CRISPR/Cas9 和donor序列: CRISPR/Cas9 分为Cas9和gRNA两部分,Cas9为核酸内切酶,负责切割DNA;gRNA由scaffold和spacer两部分构成,scaffold负责结合并激活Cas9,spacer长度在20bp左右,通过设计成和目的序列互补序列后,可引导Cas9靶向切割目的DNA序列。Donor质粒需包含待敲入序列两端800bp的同源臂。

结果展示

CRISPR/Cas9基因敲入细胞株构建流程






sgRNA克隆至表达质粒并转染293T细胞,72h后分选阳性细胞,抽提基因组DNA,进行T7E1检测,筛选切割效率最高的5’sgRNA-13’sgRNA-1用于后续质粒构建





在目的基因两端设计800bp的同源臂,构建含同源臂的Donor质粒,经测序鉴定后用于后续实验





将Cas9-sgRNA和Donor质粒共转染细胞,72小时后通过荧光标签将阳性细胞分选至96孔板中进行单克隆培养






细胞培养3-4周后,通过镜检排除非单克隆细胞,将单克隆细胞消化后取1/2裂解,抽提基因组DNA并进行测序鉴定。在鉴定的4株单克隆细胞中,两株为纯合敲入,两株为杂合敲入

参考文献

1.Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. 2013. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F.Nat Protoc. 8(11):2281-308.

2.Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. 2015. Chu VT, Weber T, Wefers B, Wurst W, Sander S, Rajewsky K, Kühn R.Nat Biotechnol. 33(5):543-8.

3.Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. 2014. Lin S, Staahl BT, Alla RK, Doudna JA.eLife. 3:e04766.