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钙离子成像

钙离子成像技术是通过钙离子荧光探针将外源性荧光信号和生理现象耦合起来,通过荧光染料信号的改变反映细胞内游离钙离子浓度,以表征细胞状态的一种技术。


为什么要检测钙离子信号?

钙离子是哺乳动物神经元中必需的细胞内信使,在静息状态下,大多数神经元的胞内钙离子浓度大约为50~100nM,其在电活动期间可瞬时升高10~100倍。钙离子作为细胞内的信号可触发响应,例如改变基因的表达和突触囊泡中神经递质的释放。由于细胞内有离子泵在各种信号刺激下选择性地运输这些离子,胞内钙浓度是高度动态的。钙成像技术利用钙离子流的优势和特殊的荧光染料或者蛋白质荧光探针(钙离子指示剂,calcium indicator),在活神经细胞上直接可视化钙信号,从而达到监测神经元活动的目的,已被广泛应用于神经系统方面的研究。

基本原理

目前,使用较多的钙离子指示剂主要包括化学荧光指示剂和荧光蛋白指示剂两大类。荧光蛋白钙指示剂,又称为遗传编码钙指示剂(genetically encoded calcium indicators,GECIs),可分为两种类型,对于FRET-based GECI,当环境中不存在钙离子时,在440nm的激发波长下,ECFP产生蓝色荧光,Venus不产生荧光;而当存在钙离子时,钙离子与钙调蛋白CaM结合,在440nm激发波长下ECFP发生能量共振转移至Venus,最终产生黄色荧光;对于Single-fluorophore GECI,在钙的存在下,钙调蛋白-M13相互作用引起荧光团环境中的构象变化,导致荧光发射增加。


目前常用的荧光蛋白指示剂有Cameleons、TN-XXL、GCaMP、Pericams和Camgaroo等。GCaMP系列蛋白(Single-fluorophore)特别是GCaMP6系列蛋白是最主要的钙离子指示剂,且越来越多地被用于体内钙成像研究。GCaMP6比GCaMP3强10倍,动力学快2倍。其中GCaMP6s (slow),6m (medium),6f (fast)分别代表慢,中,快三种动力学性质(动力学越快越适合检测快速变化的钙信号)。GCaMP6s荧光变量最大,GCaMP6f最灵敏。

基于FRETGECIA)和单荧光蛋白GECIB)作用原理示意图


应用方向

钙成像技术主要应用于神经系统研究,以研究在错综复杂的神经系统中钙离子的变化。包括以下几方面:


1. 体外研究突触前和突触后的功能结合钙离子成像和双光子显微镜技术,研究者发现钙离子信号受限于树突棘(神经元之间兴奋传递的突触后位点)

2. 体内研究神经元的树突和树突棘的活动通过钙离子成像记录单根树突以及树突棘的钙离子信号可以精准地知道是神经元上的哪些部位参与了神经元反应

3. 体内研究不同动物模型的神经元电路目前利用钙成像技术在啮齿类、果蝇、线虫、斑马鱼甚至灵长类动物中都能进行单个细胞的动作电位记录

4. 研究行为动物的神经元活动钙成像技术的发展使得实时记录休息或者运动状态下的动物的神经元反应都成为可能


钙离子成像常用病毒工具

钙离子成像常用的病毒工具——AAV钙指示剂


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货号 载体名称 启动子 启动子表达位置 主要元件 荧光 表达方式
AAV00041 pAAV-CAG-Flex-GCaMP6(S) Cag 谷氨酸能神经元 Flex-GCaMP6(S) Cre诱导表达
AAV00068 pAAV-CaMKlla-GCaMP6f-P2A-nls-dTomato CaMKlla 谷氨酸能神经元 GCaMP6(F) dTomato 正常表达
AAV00073 pAAV-CaMKlla-GCaMP6f CaMKlla 谷氨酸能神经元 GCaMP6(F) 正常表达
AAV00074 pAAV-CaMKlla-GCaMP6s CaMklla 谷氨酸能神经元 GCaMP6(S) 正常表达
AAV00075 pAAV-CaMilla-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato CaMKlla 广谱 GCaMP6(S) dTomato 正常表达
AAV00044 AAV-CMV-GCaMP6(F) CMV 广谱 GCaMP6(F) 正常表达
AAV00045 pAAV-CMV bGlobin-GCaMP6(S)- 3Flag CMV-bGlobin 广谱 GCaMP6(S) 3Flag 正常表达
AAV00092 pAAV- EF1a-DI0-GCaMP6f-P2A-nls-dTomato EF1a 广谱 DIO-GCaMP6f dTomato Cre诱导表达
AAV00094 pAAV-EF1a-DIO-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato EF1a 神经元 DIO-GCaMP6f dTomato Cre诱导表达
AAV00054 pAAV-hSyn-GCaMP6(F) hSyn 神经元 GCaMP6(F) 正常表达
AAV00058 pAAV-hSyn1-mRuby2-GSG-P2A-GCaMP6F-WPRE -PA hSyn 神经元 GCaMP6(F) mRuby2 正常表达
AAV00063 pAAV-hSyn-Flex- GCaMP6f hSyn 神经元 GCaMP6(F) 正常表达
AAV00067 pAAV-hSyn1-GCaMP6f-P2A-nls-dTomato hSyn 神经元 GCaMP6(F) dTomato 正常表达
AAV00032 pAAV-hSyn1-GCaMP6s-P2A-nls-dTomato hSyn 神经元 GCaMP6(S) nls-dTomato 正常表达
AV00053 pAAV-hSyn-GCaMP6s hSyn 神经元 GCaMP6(S) 正常表达
AAV00059 pAAV-hSyn1-mRuby2-GSG-P2A-GCaMP6s-WPRE -pA hSyn 神经元 GCaMP6(S) mRuby2 正常表达
AAV00064 pAAV-hSyn-Flex-GCaMP6s hSyn 神经元 GCaMP6(S) 正常表达


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如何使用钙离子成像病毒工具进行研究

Step1:选择合适的钙离子指示剂

钙离子指示剂分为化学荧光指示剂和GECI指示剂,其中GECI指示剂GCaMP6f和GCaMP6s被广泛应用于活体钙成像研究。


Step2:将钙离子指示剂转运至目标部位

化学荧光指示剂通常采用电极刺穿或借助乙酰氧基甲酯和右旋葡萄糖的方式进入到目标部位,而GECI指示剂则主要借助于病毒感染的方式导入至目标部位。


Step3:收集信号,记录结果

钙离子成像技术通常与显微镜技术连用来记录钙离子的变化。


钙成像技术示意图

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