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神经注射

神经科学是近年来快速发展的前沿学科,以病毒载体为介导的机制研究、基因治疗及神经环路是神经研究的热点。

常用细胞模型

疾病模型 造模方法 参考文献
阿尔茨海默病模型 20μmol/L的Aβ25-35加入海马原代细胞孵育24h 1
帕金森病模型 10μmol/L的MPP+加入中脑细胞孵育48h 2
兴奋性谷氨酸损伤模型 100μmol/L的谷氨酸盐作用于皮质原代细胞5min 3


参考文献

1. MP Mattson, Y Goodman, H Luo, et al. Activation of NF-kappa B protects hippocampal neurons against oxidative stress-induced apoptosis: evidence for induction of manganese superoxide dismutase and suppression of peroxynitrite production and protein tyrosine nitration. J Neurosci Res, 1997, 49(6): 681-697.

2. X Cai, H Jia, Z Liu, et al. Polyhydroxylated fullerene derivative C60(OH)24 prevents mitochondrial dysfunction and oxidative damage in an MPP+-induced cellular model of Parkinson's disease. Journal of Neuroscience Research, 2008 , 86(16): 3622.

3. SL Budd, DG Nicholls. Mitochondria, calcium regulation, and acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neurochemistry, 1996, 67(6): 2282-2291.

工具病毒选择指南

作为神经系统研究的关键工具,病毒载体具有感染效率高、操作方便等优势,比较常用的病毒载体包括腺相关病毒、慢病毒、腺病毒等,如何根据自己的实验需求选择合适的病毒载体呢?


1.  慢病毒:慢病毒对原代神经元细胞感染效率高、毒性低、损伤小,在感染后 2-4 天开始表达,并且可以长时间稳定表达外源基因,因此原代神经元细胞感染,通常首选慢病毒。在体注射时,慢病毒的优点是可以将靶基因整合入宿主的基因组中持续稳定的表达,且引起来的免疫反应温和,可用于定点注射。
2.  腺病毒:神经领域的研究较少使用腺病毒载体进行,因其易引起较强烈的免疫反应,严重时可导致实验动物死亡。
3.  腺相关病毒(AAV):与慢病毒相比,AAV体积小,滴度高,扩散性好,且具有更强的嗜神经特性。运用AAV载体的另一个显著优点是有些AAV血清型,如PHP.eB,可穿过血脑屏障、胎盘屏障,可通过尾静脉注射使用。此外AAV1,AAV Retro等血清型还可用于神经环路标记。




了解了这些病毒载体在神经系统应用中的优势和不足后,如何根据具体的实验需求和基因情况选择合适的病毒载体呢?我们需要考虑这几个方面:

1. 工具载体的表达时间与实验观察时间是否相符;

2. 工具载体可以容纳的片段大小与目的基因大小是否契合;

3. 工具载体对目的细胞、在体组织的转导是否足够高效。


下表总结了常用基因操作工具的选择方法:

病毒表达系统 慢病毒 腺病毒 腺相关病毒
外源基因表达时间 2-4天开始表达长时间稳定表达 1-2天开始表达持续7-14天 7-14开始表达
细胞分裂不旺盛部位可长时间表达
插入片段大小 <4kb <5-8kb <2.8kb (包括必须的启动子
以及荧光或者标签元件)
稳定细胞株筛选 可以,外源基因整合于
宿主基因组,筛选简单
不可以,瞬时表达外
源基因传代后效果减弱
不可以
细胞实验 首选,广谱,感染效率高 广谱,感染效率高,
适合原代非增殖细胞感染
不适合细胞实验
动物实验 适合,根据观察时间和注射部位选择 较适合(免疫原性高),根
据观察时间和注射部位选择
首选,根据观察时间和注射部位选择
滴度 最高可达109TU/ml 高达1012pfu/ml 高达1012-13v.g/ml




吉凯小建议

1.  在体实验建议选择腺相关病毒,它具有滴度高,扩散效果好,免疫原性低等特点。且AAV 1/2/5/8/9/retro/ PHP.eB/ PHP.S 等血清型对神经系统均具有较好的亲和性,如1型可作为顺行示踪跨单突触标记的血清型使用 、9型可作为顺行示踪非跨突触标记的血清型使用、Retro可作为逆向示踪非跨突触标记的血清型使用。 PHP.eB,适合中枢神经系统,可穿过血脑屏障、胎盘屏障,常通过尾静脉注射使用;PHP.S,适合周围神经系统,可穿过血脑屏障、胎盘屏障,常通过尾静脉注射使用。


1 2 5 6 8 9 DJ PHP.eB PHP.S Retro
心脏






肝脏












胰腺






骨骼肌




神经

眼部





2.  原代神经元体外感染建议选择慢病毒:慢病毒在感染原代神经元后2-4 天开始表达,且对神经元细胞的毒性低、损伤小。

3.  如需目的基因在某一类神经元或胶质细胞中特异性表达,可使用特异性启动子。吉凯提供组织特异性启动子载体的病毒包装服务,点击了解>>

组织 启动子名称 启动子特性
神经 hSyn 神经元特异性启动子
mecp2 较短的神经元特异性启动子
TUBA1A 早期神经元特异性启动子
c-fos 兴奋神经元启动子
CaMKlla 前脑谷氨酸能神经元特异性启动子
hAGAT GABA能神经元/中间神经元特异性启动子
Slc6a3 多巴胺神经元特异性表达启动子
gfaABC1D 星形胶质细胞特异性启动子
lba1 小胶质细胞特异性启动子
CNP 少突胶质细胞或施万细胞特异性表达启动子

注射方法

在神经科学的研究方法中,为了使各种处理手段(给药、毁损、病毒注射等)或信号采集(微电极、探针)到达目的脑区的相应位置,需要使用脑立体定位技术。下面以小鼠为例做详细介绍:


第一部分:实验前准备

准备内容:脑立体定位仪,常规手术器械,颅骨钻,微量注射器,干棉球,1% 的戊巴比妥钠,生理盐水,1ml 注射器,小鼠。

1. 首先,用1% 的戊巴比妥钠,以腹腔注射的方式麻醉小鼠,注射量为80mg/kg 小鼠。

2. 然后,从饲养笼中取出小鼠。

3. 5-10min 后,麻醉剂起效。

4. 待小鼠麻醉后,用剃毛器将小鼠头部毛发剔除干净。




第二部分:固定小鼠

1. 将麻醉剔毛后的小鼠固定到立体定位仪上。

2. 固定时,先将小鼠门齿卡在适配器门齿夹上,轻轻压上门齿夹横杆,调整适配器高度和前后,使耳杆可以方便进入小鼠外耳道。

3. 左手托起小鼠头部,将左侧耳杆插入小鼠耳道,调节左右侧耳杆使动物头部保持在U 型开口的中心位置,先锁紧固定一侧耳杆,后旋紧另一侧耳杆,使动物头部不能晃动,同时旋紧门齿夹螺丝。

4. 检查是否固定成功:鼻对正中,头部不动,提尾不掉,目测大脑放置水平。

5. 用脱毛膏或者剃刀将需要手术部位的毛发去除。

6. 然后用手术刀划开小鼠头部皮肤,去除颅骨表面结缔组织,暴露前后囟

7. 根据脑图谱,确定待注射脑区的位置参数,包含离Bregma Lambda点的距离以及核团深度。

8. 以Bregma 0 点,按照预先确定好的坐标移动颅骨钻,打开合适大小的骨窗(窗口尽量小但是又不妨碍实验)。小心地用颅骨钻在注射位点处轻磨颅骨,将颅骨慢慢打薄,当颅骨出现裂缝的时候,用医用注射器的针头小心挑破,防止损伤,如果在此过程中有出血,可以用很小的医药棉球拉成长条形将血吸走,钻孔时一定要控制好,否则很容易在钻通颅骨后一不小心钻头进入脑组织,造成损伤。




第三部分: 注射病毒

1. 用PBS 冲洗微量注射器(5μl 规格)3-5 次。

2. 先吸取1μl 空气,再吸取1μl 稀释好的病毒( 方便病毒充分注射进脑)

在空气中测试注射器是否通畅;

3. 将微量注射泵,微量注射器组装好,置于钻好的孔上方,针尖与颅骨平行(Z=0),微调注射器位置使之与之前钻孔时位置相同。

4. 根据定好的深度将注射针缓慢下降





吉凯小建议:

a. 注射病毒前,为确定核团定位是否正确,建议您使用神经顺行示踪的DiI染料于注射后1周,神经逆行示踪的荧光金(Flouro gold)染料于注射后2周切片,并对照图谱确认注射的核团位点无误,再进行病毒注射,可有效提高病毒标记的成功率。

b. 注意小鼠的状态:由于俯卧体位以及脑立体定位仪的夹持,容易造成小鼠窒息死亡,因此需要随时确认小鼠气道通畅。另外,对于手术切开的部位,应适当滴加生理盐水,防止伤口干燥。

c. 大鼠颅骨水平位定位操作:定位时将大鼠固定成颅骨水平位后,先定位到前囟,以前囟为原点,向前或向后、向左或向右、向下(先在颅骨上打孔)到达核团位置,需要强调的是,坐标是以前囟为原点,而不是以钻孔后的脑表面为原点。

d. 冰冻切片时注意,先从所要核团外开始切(还不到核团所在层面),拿到的切片对照图谱中的一些参照物来判断核团是否准确(对照物可选大而清晰的海马、视交叉,脑室、核团附近的特殊结构如纤维索等等),切片同时注意调节冻台角度,使切片角度与图谱一致。


更多病毒注射操作视频,点击查看>>

用量参考

神经系统病毒用量参考
以下表格中为吉凯客户应用文献总结(部分)。更多神经系统病毒注射参数,点击查看与下载>>


1. 腺相关病毒AAV

注射
物种
注射
部位
AAV
类型
基因名称 血清型 注射
参数
检测
时间
文献名
大鼠 基底外侧
杏仁核BLA
过表达 DHHC12 DHHC12 1ul/位点 4周 Gephyrin Palmitoylation in Basolateral Amygdala Mediates the Anxiolytic Action ofBenzodiazepine. Biological Psychiatry
小鼠 腹侧海马 干扰和过表达 SIK2
CRTC1
CREB
BDNF
TrkB
AAV2/8 双侧注射,注射速
率:0.2μl/min(1μl/side),
注射后停留4min。
4周 Hippocampal Salt-Inducible Kinase 2 Plays a Role in Depression Via the CREB-Regulated Transcription Co-activator 1-Cyclic AMP Response Element Binding- Brain-Derived Neu-rotrophic Factor Pathway. Biological Psychiatry
小鼠 双侧CA1 过表达 caspase- 1 AAV1 1μl/位点,
共2μl。注射速率:
0.2μl/min。
停留时间: 10min
14天 Gene deficiency and pharmacological inhibition of caspase- 1 confers resil-ience to chronic social defeat stress via regulatingthe stability of surface AMPARs. Molecular Psychiatry
小鼠 海马 干扰 LH3
双侧注射。
1μl/侧。注射速率:
0.2μl/min。 注射5min。
保留时间: 5min

Hippocampal PPARα is a novel ther-apeutic target for depression and apeutic target for depression and mediates the antidepressant of fluoxetine in mice. British journal of actions pharmacology.
小鼠
干扰 PPARa AAV9 滴度: 3 x 1012
viral particles/ml

Overexpression of LH3 reduces the incidence of hypertensive intracere-bral hemorrhage in mice. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM
大鼠 右背侧和
腹侧海马
干扰和过表达 LncRNA H19 AAV9 3μl/位点,共6ul。
注射速率: 0.2μl/min
14天 Long non-coding RNA H19 contrib-utes to apoptosis of hippocampal neurons byinhibiting let-7b in a rat model of temporal lobe epilepsy. Cell Death and Disease
大鼠 周围缺血
皮质和同侧
纹状体后部
过表达 NT-1
注射总量: 1 x 1010
genome copies。注射速率: 0.2μl//min。
保留时间: 15min
3,14天 Netrin-1 Promotes Synaptic Forma-tion and Axonal Regeneration@via JNK 1/c- Jun Pathway after the8Middle Cerebral Artery Occlusion. Frontiers in Cellular Neuroscience


代表文献 吉凯客户文章Molecular Psychiatry,(2017)00,1-13



代表文献 吉凯客户文章Neuropharmacology, 128(2018) 207-220.




2. 慢病毒

注射
物种
注射
部位
注射
体积
病毒
滴度
注射
总量
注射速度
及保留时间
检测时间 文献名
小鼠 皮质 3个位点,
0.7μl/位点
2E+9 TU/mL 1.4x106T
U/位点,注射
病毒总量4.2x106 TU
注射速率0.2μl/min,
针头停留10min。
5天 Treatment of cerebral ischemia by disrupting ischemia-induced interac-tion of nNOS with PSD-95[J]. Nature medicine, 2010
小鼠 S1 barrel field 0.5μl 干扰滴度
1E+9 TU/mL
5x105TU 注射速率0.2μl/min
Oxytocin mediates early experi-ence -dependent cross -modal plas-ticity in the sensory cortices[J]. Nature neuroscience, 2014.
大鼠 对侧前边缘皮质




Deactivation of excitatory neurons in the prelimbic cortex via Cdk5 pro-motes pain sensation and anxiety.[J] .Nat Commun, 2015
大鼠 下橄榄体 1μl 1E+8 TU/mL-1E+9 TU/mL 1x 105 TU-1x 106 TU 注射速率0.2μl/min,
针头停留5min。
21天 Oxytocin mediates early experi-ence- - dependent cross- -modal plas-ticity in the sensory cortices[J]. Nature neuroscience, 2014.
大鼠 右丘脑 4个位点,3μl/位点 4E+9 TU/ml 1.2E+7TU/位点
2周 Beclin 1 knockdown inhibits auto-phagic activation and prevents the secondary neurodegenerative damage in the ipsilateral thalamus following focal cerebral infarction[J.Autophagy
大鼠 海马体CA1 5μl 1.5E+9TU/mL 7.5x106TU 注射速率0.3μl/min 14天 Neuroprotection of hypoxic postcon-ditioning against global cerebral isch-emia through influencing posttransla-tional regulations of heat shock pro-tein 27 in adult rats[J]. Brain Patholo-gy, 2017.
大鼠 海马体 5μl 2E+9 TU/mL 1x107TU 注射速率0.2μl/min,
针头保留5min
7天 Association of mitochondrial letm1 with epileptic seizures[J]. Cerebral Cortex, 2013
大鼠 背侧纹状体 双侧
1E+8 lentiviral particles
5天 Protein kinase D1-dependent phos-phorylation of dopamine D1 receptor regulates cocaine -induced behavioral responses[J]. Neuropsychopharma-cology, 2014
小鼠 海马齿状回 双侧.2μl 2E+7 TU/mL-5E+8 TU/mL 4E+4Tu-1E+6Tu
注射速率0.5μl/min,
针头保留5min
14天 CNTNAP4 Impacts Epilepsy Through GABAA Receptors Regulation: Evi-dence From Temporal Lobe Epilepsy Patients and Mouse Models.[U]. Cereb. Cortex, 2018
大鼠 小脑间位核 0.3μl 干扰滴度8E+8TU/mL
过表达2E+8TU/mL

注射3min,
针头保留5min
7天 Modulation of immune function by glutamatergic neurons in the cerebel-lar interposed nucleus via hypotha-lamic and sympathetic pathways[J].
Brain, behavior, and immunity, 2014


代表文献 吉凯客户文章 Naturen medicine,2010,16(12):1439-1443





3. 腺病毒

注射
物种
注射
部位
注射
体积
病毒
滴度
注射速度
及保留时间
注射
仪器
检测时间 文献名
小鼠 右脑室 3μl 1.3E+10pfu/ml 注射速度0.2μl/min 5μl
微量注射器

The long non-coding RNA Neat1 is an important mediator of the therapeutic effect of bexarotene on traumatic brain injury in mice[J]. Brain, Behavior, and Immunity, 2017.
大鼠 左侧脑室
1.3E+10pfu/ml
25号针头
PPAR β/δ, a Novel Regulator for Vascular Smooth Muscle CellsPhenotypic Modulation and Vas-cular Remodeling after Sub-arachnoid Hemorrthage in Rats[J]. Scientific Reports, 2017.
大鼠 背侧海马体 10μl



Notch1 Signaling Activation Con-tributes to Adult Hippocampal Neurogenesis Following Trau-matic Brain Injury[J]. Medical science monitor: international medical journal of experimental and clinical research, 2017.
大鼠 脑室 10μl 过表达腺病毒6x1010pfu/mL,
对照2x1010pfu/mL
使用时用EN.S.
稀释为1.3x 1010pfu/mL
注射后保留10min 25号针头 7天 Peroxisome Proliferator - Activat-ed Receptor β/δ Alleviates Early Brain Injury After Subarachnoid Hemorrhage in Rats. Stroke
大鼠 脑室 10μl 过表达腺病毒6x 1010pfu/mL,
对照2x1010pfu/mL
使用时用EN.S.
稀释为1.3x1010pfu/mL
注射速度0.5μl/min,
注射后保留10min
26号针头
Endogenous hydrogen sulphide attenuates NL RP3 inflam-masome-mediated neuroinflam-mation by suppressing the P2X7 receptor after intracerebral hae-morrhage in rats[J. Journal of neuroinflammation, 2017.


代表文献 吉凯客户文章 Brain,Behavior,and lmmunity,2017

引用文献

1. Treatment of cerebral ischemia by disrupting ischemia-induced interaction of nNOS with PSD-95[J]. 2010, Nature medicine (IF= 32.621). 吉凯产品:慢病毒  研究领域:脑缺血  南京医科大学

2. Oxytocin mediates early experience-dependent cross-modal plasticity in the sensory cortices[J]. 2014, Nature neuroscience (IF= 19.912). 吉凯产品:慢病毒  研究领域:神经  中科院神经科学研究所

3. A Critical Role of Presynaptic Cadherin/Catenin/p140Cap Complexes in Stabilizing Spines and Functional Synapses in the Neocortex. 2017, Neuron (IF=14.024). 吉凯产品:RNAi慢病毒  研究领域:神经    中国科学院神经科学研究所

4. Gephyrin Palmitoylation in Basolateral Amygdala Mediates the Anxiolytic Action of Benzodiazepine. Biological Psychiatry (IF= 11.982). 吉凯产品:过表达AAV  研究领域:焦虑症  华中科技大学同济医学院

5. Gene deficiency and pharmacological inhibition of caspase-1 confers resilience to chronic social defeat stress via regulating the stability of surface AMPARs. Molecular Psychiatry (IF= 11.64). 吉凯产品:过表达AAV  血清型:AAV1  研究领域:抑郁症  华中科技大学同济医学院

6. Hippocampal PPARα is a novel therapeutic target for depression and mediates the antidepressant actions of fluoxetine in mice. British journal of pharmacology (IF= 6.81). 吉凯产品:干扰AAV  研究领域:抑郁症  南通大学药学院

7. Overexpression of LH3 reduces the incidence of hypertensive intracerebral hemorrhage in mice. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM (IF=6.045). 吉凯产品:干扰AAV  血清型:AAV9  研究领域:高血压性脑出血  中国医学科学院阜外医院

8. Melatonin-mediated inhibition of Cav3.2 T-type Ca2+ channels induces sensory neuronal hypoexcitability through the novel protein kinase C-eta isoform. 2018, Journal of Pineal Research (IF= 11.613). 吉凯产品:干扰腺病毒  研究领域:神经  苏州大学

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