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眼睛个体小、相对封闭、具备免疫赦免,是基因治疗中非常热门的器官。随着视网膜和视皮层遗传性疾病分子机制研究的不断深入,使用基因治疗某些遗传性眼部疾病(如视网膜色素变性、缺血性视网膜疾病等)已成为可能。目前使用较多的是通过病毒载体介导将治疗基因导入视网膜色素上皮层、视皮层神经元和光感受器等区域,在常见的病毒载体中,腺相关病毒AAV使用较广泛。

工具病毒选择指南

眼部研究如何挑选合适的工具病毒

慢病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV)等都是常用的工具病毒载体,在眼部的研究中该如何选择呢?


1.  慢病毒:慢病毒的优点是可以将靶基因整合入宿主的基因组中持续稳定的表达,引起的免疫反应较为温和且安全性高。
2.  腺病毒:腺病毒的载体容量大于慢病毒和AAV,适合大片段基因的病毒包装。但腺病毒的免疫原性较大,容易引起动物死亡,且在体表达时间短,不适合需要长期观察的研究。
3.  腺相关病毒AAV:AAV具有体积小、滴度高的优势,病毒颗粒可扩散并感染深层组织,同时其还具有免疫原性低、表达时间长的特点,尤其适合眼部注射的动物实验。影响AAV载体在眼部基因转移的因素包括AAV载体的血清型、基因转移途径、组织特异性启动子等。AAV有多种血清型,其中2型、5型、8型、9型等对眼部的趋向性较高。




了解了这些病毒载体在眼部应用中的优势和不足后,需要根据具体的实验需求和基因情况选择合适的病毒载体,吉凯建议您可以从以下这几个方面出发:

1. 工具载体的表达时间与实验观察时间是否相符;

2. 工具载体可以容纳的片段大小与目的基因大小是否契合;

3. 工具载体对目的细胞、在体组织的转导是否足够高效。


吉凯基因总结了常用基因操作工具的选择方法,您可以根据具体实验需求选择合适的病毒载体:

病毒表达系统 慢病毒 腺病毒 腺相关病毒
外源基因表达时间 2-4天开始表达
长时间稳定表达
1-2天开始表达
持续7-14天
7-14开始表达
细胞分裂不旺盛部位可长时间表达
插入片段大小 < 4kb < 5-8kb <2.8kb (包括必须的启动
子以及荧光或者标签元件)
稳定细胞株筛选 可以,外源基因整合于
主基因组,筛选简单
不可以,瞬时表达外源
基因传代后效果减弱
不可以
细胞实验 首选,广谱,感染效率高 广谱,感染效率高,
适合原代非增殖细胞感染
不适合细胞实验
动物实验 适合,根据观察时间
和注射部位选择
较适合(免疫原性高),
根据观察时间和注射部位选择
首选,根据观察时间和注射部位选择
滴度 最高可达109TU/ml 高达1012pfu/ml 高达1012-13v.g/ml

常用基因操作工具选择指南




吉凯小建议:

1.  在基因大小允许的前提下,建议您优先选择AAV。AAV体积小,滴度高,尤其适合眼部病毒注射。且AAV有多种血清型,其中2型、5型、8型、9型等对眼部的趋向性较高。点击了解更多AAV血清型选择小窍门>>


1 2 5 6 8 9 DJ PHP.eB PHP.S Retro
心脏






肝脏












胰腺






骨骼肌




神经

眼部




AAV 血清型的趋向性


2.  可使用组织特异性启动子提升靶基因的特异性表达,如视网膜特异性启动子rpe65。吉凯基因提供组织特异性启动子载体的病毒包装服务,点击了解>>

注射方法

工具病毒眼部注射方法

病毒载体介导的眼部基因转移途径依治疗目的不同主要有玻璃体腔注射、视网膜下注射、前房注射、结膜下注射等。下面以角膜下注射为例做详细说明:

1、实验开始前,先将小鼠进行麻醉。
2、然后将小鼠固定在台上,并将眼球部分突出。
3、夹紧小鼠头部,并对其角巩膜缘处进行扎孔。扎孔时,一般选择角膜缘后1mm 位置,注意避开血管。
4、判断是否扎孔成功。
5、扎孔成功后,开始注射病毒。
6、注射时,针尖垂直进入,随后倾斜,缓慢推注。



角膜下病毒注射
(参考文献:Journal of Neuroscience Methods, 2008, 167 (2) :191)


更多部位病毒体内注射操作视频,点击查看>>

用量参考

眼部注射病毒用量参考

以下表格中为吉凯客户应用文献总结(部分)。更多眼部注射病毒注射参数,点击查看与下载>>


1.  腺相关病毒AAV

注射部位

AAV类型

血清型

注射参数

检测时间/天

文献名

大鼠单侧视网膜

AAV-GFP

AAV2、AAV1

2ul。2×109vg

1, 3, 5, 7, 14, 28,
60, 120, 180,
240, and 360

Distinctive Gene Transduction Efficiencies of
Commonly Used Viral Vectors in the Retina[J].
Current Eye Research

小鼠视网膜

过表达AAV

AAV2/8

滴度3.5×1012genome copies/mL。
1ul/位点。
左侧注射过表达AAV,
右侧PBS

30天

Human melanopsin-AAV2/8 transfection to retina transiently restores visual function in rd1 mice [J].
International Journal of Ophthalmology


代表文献 Science,2010,329(5990):413.





2.  慢病毒

注射部位 注射参数 检测时间/天 文献
大鼠视网膜 2 μL
注射总量1E+6 TU
使用33号针头
第3, 14, 180, 240 Distinctive gene transduction efficiencies of commonly used viral vectors in the retina[J]. Current eye research, 2008.
大鼠玻璃体 10 μ L/eye
病毒滴度1E+9 TU/ml
总量1E+7 TU

MicroRNA-21 could promote the apoptosis of retinal neurons by down-regulating PDCD4 in a rat model of diabetes mellitus[J]. Int J Clin Exp Med, 2017.
大鼠玻璃体 5 μL
病毒滴度9E+8 TU/ml
总量4.5E+6 TU
使用30号针头
每7天检测一次 Apelin is essential for the development of laser-induced choroidal neovascularization model[J]. Int 」Clin ExpPathol, 2017.
大鼠玻璃体 5 μL
病毒滴度2E+9 TU/mi
总量1E+7 TU
每7天检测一次 Inhibition of choroidal neovascularization by lentivi-rus-mediated PEDF gene transfer in rats[J]. International journal of ophthalmology, 2016.
小鼠玻璃体 2 uL
病毒滴度2E +9 IU/ml
总量4E+6 IU

Lentivirus vector-mediated knockdown of erythropoie-tin-producing hepatoellular carcinoma receptors B4 inhibits laser -induced choroidal neovascularization[J]. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics, 2013.
小鼠玻璃体 1.5 uL
病毒滴度3E+8 TU/ml
总量4.5E+5 TU
使用33号针头

Ephrin-A4 Is Involved in Retinal Neovascularization by Regulating the VEGF Signaling PathwayEphrin-A4 Is Involved in Retinal Neovascularization[J]. Investigative ophthalmology & visual science, 2012.




3.  腺病毒

注射部位 注射参数 检测时间 文献
大鼠视网膜 2 μl。总量:
过表达2.16E+10 genome copies.
对照4.4E+10 genome copies
每两周 Overexpression of melanopsin in the retina restores visual function in Royal College of Sur-geons rats[J]. Molecular medicine reports, 2016.
大鼠视网膜 2 μl
总量1E+6 pfu
使用33号针头
1,3, 5, 7, 14,
28, 60, 120,
180,240,360
Distinctive gene transduction fficiencies of com-monly used viral vectors in the retina[J]. Current eye research, 2008.
小鼠玻璃体 1 μl
Adenoviral Vector-Mediated Delivery of p21WAF1/CIP1 Prevents Retinal Neovascular-ization in an Oxygen-Induced Retinopathy Model [J. Current eye research, 2016.
小鼠玻璃体 1 μl。总量1E+9 PFU 5天 Inhibition of Oxygen-Induced Ilschemic Retinal Neovascularization with Adenoviral 15-Lipoxy-genase-1 Gene Transfer via Up-Regulation of PPAR-Y and Down-Regulation of VEGFR-2 Expression[J. PloS one, 2014.
小鼠玻璃体 1 μl。总量1E+9 PFU 5天 Silencing of S100A4, a metastasis associated protein, inhibits retinal neovascularization via the downregulation of BDNF in oxygen-induced isch-aemic retinopathy[J]. Eye, 2016.
小鼠玻璃体 1 μl。总量1E+9 PFU 6天 Overexpression of 15-ipoxygenase-1 in oxy-gen-induced ischemic retinopathy inhibits retinal neovascularization via downregulation of vascular endothelial growth factor-A expression[J]. Mo-lecular vision, 2012.

引用文献

1. Distinctive Gene Transduction Efficiencies of Commonly Used Viral Vectors in the Retina[J]. Current Eye Research (IF= 2.12). 吉凯产品:AAV-GFP  血清型:AAV2、AAV1  研究领域:视网膜病毒载体转染效率  上海交通大学附属第一人民医院

2. Human melanopsin-AAV2/8 transfection to retina transiently restores visual function in rd1 mice [J]. International Journal of Ophthalmology (IF= 1.166). 吉凯产品:过表达AAV     血清型:AAV2/8  研究领域:AAV2/8对视网膜转染效率研究  第三军医大学西南眼科医院

3. Deacetylation of MnSOD by PARP-regulated SIRT3 protects retinal capillary endothelial cells from hyperglycemia-induced damage[J]. 2016, Biochemical and biophysical research communications (IF= 2.559). 吉凯产品:慢病毒  研究领域:MnSOD去乙酰化对视网膜毛细血管内皮细胞的保护机制研究  上海交通大学附属第一人民医院

4. Ephrin-A4 Is Involved in Retinal Neovascularization by Regulating the VEGF Signaling PathwayEphrin-A4 Is Involved in Retinal Neovascularization[J]. 2012, Investigative ophthalmology & visual science (IF= 3.388). 吉凯产品:慢病毒  研究领域:视网膜血管新生  北京大学人民医院

5. Inhibition of Oxygen-Induced Ischemic Retinal Neovascularization with Adenoviral 15-Lipoxygenase-1 Gene Transfer via Up-Regulation of PPAR-γ and Down-Regulation of VEGFR-2 Expression[J]. 2014, PloS one (IF=2.766 ). 吉凯产品:腺病毒  研究领域:视网膜血管新生  武汉大学人民医院

6. Silencing of S100A4, a metastasis-associated protein, inhibits retinal neovascularization via the downregulation of BDNF in oxygen-induced ischaemic retinopathy[J]. 2016, Eye (IF= 2.478). 吉凯产品:腺病毒  研究领域:视网膜血管新生  武汉大学人民医院

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