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慢病毒

慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种,基因组为双链RNA。但区别于一般的逆转录病毒,慢病毒具有更广的宿主范围,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。重组慢病毒载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I 型病毒)为基础,使用疱疹病毒VSVG 外壳蛋白发展起来的工具载体,其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒。慢病毒可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。


慢病毒可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,为神经领域心血管领域肝脏肌肉、肿瘤及其他领域的科研工作者们提供更强有力的基因研究工具。

优势

慢病毒与其他病毒工具比较,具有以下优势:

a. 表达时间长:慢病毒通过将外源基因整合到宿主细胞基因组上,可实现目的基因长时间稳定的表达,不随着细胞分裂传代而丢失,是细胞实验的首选;
b. 安全性高:未发现致病性,已被用于CAR-T 治疗作用于人体;
c. 免疫原性低: 直接注射活体组织不易造成免疫反应,适用于动物实验。

病毒表达系统 腺病毒
(Adenovirus)
慢病毒
(Lentivirus)
腺相关病毒
(Adeno-As sociate virus)
病毒基因组 双链DNA病毒 RNA病毒 单链DNA病毒
复制 条件复制 不可复制 条件复制
滴度 最高可达1012pfu/ml 最高可达109TU/ml 最高可达1012-13v.g/ml
感染细胞类型 感染分裂和不分裂细胞 感染分裂和不分裂细胞 感染分裂不旺盛的细胞
表达丰度 高水平表达 中到高水平表达 高水平表达
表达时间 快(1-2天) 慢(2-4天) 1-2周
持续表达时间 病毒基因组游离于宿主基因组外,
瞬时表达外源基因
病毒基因组整台于宿主基因组,
长时间、稳定表达外源基因
病毒基因组游离于宿主基因组外,
在分裂旺盛的细胞中可长时间表达
克隆容量 适合表达小于5kb的外源片段 适合表达小于4kb的外源片段 适合表达小于2.8kb的外源片段
免疫原性 较高免疫原性 低免疫原性 低免疫原性
安全性 可能会引起一些咳嗽流涕 暂无发现致病性,
已被用于CAR-T治疗作用于人体
暂无发现致病性,
已通过欧盟和FDA许可,
用作基因治疗药物的载体

包装服务


纯化工艺

吉凯独有的病毒分级纯化工艺,满足您从永生化细胞到原代和干细胞,从动物体内水平到cGMP细胞治疗等不同实验需求:


A级慢病毒纯化工艺:

通过超速离心初步浓缩慢病毒颗粒,同时去除病毒上清中的血清蛋白和宿主蛋白,大部分质粒DNA和宿主DNA,然后应用超滤,
进一步浓缩,去除质粒DNA和宿主DNA,获得高纯度慢病毒产品。







B级慢病毒纯化工艺:

通过切向流过滤系统,在浓缩慢病毒的同时,极大程度地去除DNA残留和蛋白残留,同时通过超滤进一步浓缩和纯化,获得超纯
慢病毒产品。



C级慢病毒纯化工艺:

通过阴阳离子交换层析,特异性吸附慢病毒颗粒,然后运用盐离子洗脱,获得可用于临床试验的慢病毒产品。



质量检测

慢病毒质量检测标准:

FDA和《中国药典》中针对病毒疫苗等制剂提出了病毒滴度(≥2E+8TU/ml),质粒残留(≤4E+8-copy/ml),宿主DNA
残留(≤10ng/ml),BSA残留(≤50ng/ml)等产品质量和安全性的纯度要求,同时针对污染和载体安全性,提出了支原体,
细菌等微生物安全和RCL的要求。吉凯基因根据中国药典法质量标准,将病毒样品送至专业检测机构,严格测定每一生产批次慢
病毒的各项指标。

检测项目 检测方法 检测结果 单位 参考检测范围
支原体 Nest PCR 阴性 .. 阴性
内毒素 LAL 合格 EU/mI ≤50
衣原体 培养法 阴性 .. 阴性
细菌 培养法 阴性 .. 阴性
真菌 培养法 阴性 .. 阴性
活性滴度 绝对定量 1.00E+08 TU/mI ≥1E+8TU

吉凯病毒质量检测标准




慢病毒鉴定方法:

吉凯基因使用精准的绝对定量qPCR法与GFP荧光计数法检测活性病毒的感染滴度。这两种检测方法直接测定的是插入到细胞基
因组的病毒基因组拷贝数,最接近真实滴度。而绝对定量qPCR法更是医疗级病毒产品公认的滴度检测方法,测定滴度更准确,
杜绝虚假。

检测项目 原理 优点 缺点
GEP荧光计数法 FACS(流式细胞计数) 经典方法,重复性好
检测活性病毒的感染滴度
对仪器和操作要求高
操作复杂
绝对定量qPCR法
(DNA定量法)
病毒感染工具细胞后,抽提整合目的片段的细胞基因组DNA,与标准品比较 检测活性病毒的感染滴度
最接近真实滴度
对仪器和操作要求高
操作复杂
RT-qPCR法
( RNA基因组法)
病毒梯度稀释感染工具细胞后,抽提RNA,RT-qPCR检测病毒基因组表达 检测活性病毒的感染滴度 受限于病毒感染后检测
基因的表达丰度
p24核心蛋白
ELISA定量法
利用慢病毒颗粒稳定表达的p24蛋白进行ELISA检测 简单,快捷,重复性好 反映的是病毒物理颗粒数不是活性滴度

市场常见滴度检测方法比较




想要了解吉凯基因慢病毒包装完整流程,请点击这里下载慢病毒构建包装报告>>

载体选择

吉凯提供完善的慢病毒产品体系,用于操作编码基因和非编码基因,如lncRNA、microRNA、circRNA。以下慢病毒载体可供您选择,点击查看载体图谱>>
调控方式 载体编号 元件顺序 原核抗性 真核抗性 荧光标记
启动子
荧光标记 RNAi/过表达
启动子
过表达 GV365 Ubi-MCS-3FLAG
-CMV-EGFP
Ampicillin CMV GFP Ubiquitin
GV320 Ubi-MCS-3FLAG
-SV40-Cherry
Ampicillin SV40 Cherry Ubiquitin
GV341 Ubi-MCS-3FLAG
-SV40-puromycin
Ampicillin Puromycin Ubiquitin
GV358 Ubi-MCS-
3FLAG
-CMV-EGFP
Ampicillin Puromycin SV40 GFP Ubiquitin
GV492 Ubi-MCS-3FLAG-
CBh-gcGFP-IRES
-puromycin
Ampicillin Puromycin CBh GFP Ubiquitin
过表达
Tet-on
GV308 TetllP-MCS-3FLAG
-Ubi-TetR-IRES
-Puromycin
Ampicillin Puromycin TtlIP
干扰 GV112 hU6-MCS
-CMV-
Puromycin
Ampicillin Puromycin U6
GV115 hU6-MCS-CMV-
EGFP
Ampicillin CMV GFP U6
GV248 hU6-MCS-Ubiquitin
-EGFP-IRES-
puromycin
Ampicillin Puromycin Ubiquitin GFP U6
GV298 U6-MCS-Ubiquitin
-Cherry-IRES-
puromycin
Ampicillin Puromycin Ubiquitin Cherry U6
GV493 hU6-MCS-CBh-
gcGFP-IRES-
puromycin
Ampicillin Puromycin CBh GFP U6
干扰Tet-on GV307 TetlIP-TurboRFP
-MCS(MIR30)-Ubi-
TetR-IRES
-Puromycin
Ampicillin Puromycin TetlIP RFP TetlIP
miRNA-up GV369 Ubi-MCS-SV40
-EGFP-IRES
-puromycin
Ampicillin Puromycin SV40 GFP Ubiquitin
GV209 H1-MCS-CMV
-EGFP
Ampicillin CMV GFP H1
GV309 hU6-MCS-Ubiquitin
-EGFP-IRES
-puromycin
Ampicillin Puromycin Ubiquitin GFP U6
miRNA-down GV280 hU6-MCS-Ubiquitin
-EGFP-IRES
-puromycin
Ampicillin Puromycin Ubiquitin GFP U6
GV234 hU6-MCS-CMV
-EGFP
Ampicillin CMV GFP U6

应用案例

1. 细胞感染

慢病毒可有效感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

了解慢病毒细胞感染操作及更多细胞推荐MOI 请点击这里>>




2. 在体注射

2.1 神经系统

代表文献 吉凯客户文章Nature medicine,2010.16(12):1439-1443.

文献来源:Treatment of cerebral ischemia by disrupting ischemia-induced interaction of nNOS with PSD-95.




2.2  心血管系统

代表文献 Circulation,2016:CIRCULATIONAHA,116.017949.

文献来源:Inhibition of aberrant microRNA-133a expression in endothelial cells by statin prevents endothelial dysfunction by targeting GTP cyclohydrolase 1 in vivo.




2.3  肝脏

代表文献 吉凯客户文章 Joumal fo virology, 2016, 90(4): 1729-1740.

文献来源:Hepatitis B virus X protein induces hepatic steatosis by enhancing the expression of liver fatty acid binding protein.




2.4  肺

代表文献 Cell death & disease, 2017, 8(1): e2566.

文献来源:MicroRNA-101 inhibits invasion and angiogenesis through targeting ITGA3 and its systemic delivery inhibits lung metastasis in nasopharyngeal carcinoma.




更多部位体内注射参数,点击查看与下载>>

更多体内注射实验操作视频,点击查看与下载>>


引用文献

1. The metabolic ER stress sensor IRE1α suppresses alternative activation of macrophages and impairs energy expenditure in obesity. 2017, NATURE IMMUNOLOGY (IF=21.506). 吉凯产品:过表达慢病毒 研究领域:能量代谢  中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所

2. Cardiac Fibroblast-Specific Activating Transcription Factor 3 Protects Against Heart Failure by Suppressing MAP2K3-p38 Signaling. 2017, Circulation (IF=19.309). 吉凯产品:RNAi慢病毒 研究领域:心脏衰竭  首都医科大学附属北京安贞医院

3. MicroRNA 301A Promotes Intestinal Inflammation and Colitis-Associated Cancer Development by Inhibiting BTG1. 2017, Gastroenterology (IF=18.392). 吉凯产品microRNA慢病毒 研究领域小肠和结肠炎症  上海市第十人民医院

4. A Critical Role of Presynaptic Cadherin/Catenin/p140Cap Complexes in Stabilizing Spines and Functional Synapses in the Neocortex. 2017, Neuron (IF=14.024). 吉凯产品RNAi慢病毒 研究领域神经  中国科学院神经科学研究所

5. EphrinB2 Regulates Cardiac Fibrosis Through Modulating the Interaction of Stat3 and TGF-β/Smad3 Signaling. 2017, Circulation Research (IF=13.965). 吉凯产品:RNAi慢病毒和过表达慢病毒  研究领域:心脏纤维化  浙江大学医学院附属第二医院

6. Aldehyde dehydrogenase-2 (ALDH2) opposes hepatocellular carcinoma progression by regulating AMP-activated protein kinase signaling in mice. 2017, Hepatology (IF=13.246). 吉凯产品:过表达慢病毒  研究领域:肝癌  第二军医大学
7. PD‐1 Checkpoint Blockade in Combination with an mTOR Inhibitor Restrains Hepatocellular Carcinoma Growth Induced by Hepatoma Cell‐Intrinsic PD‐1. 2017, Hepatology (IF=13.246). 吉凯产品:过表达慢病毒  研究领域:肝癌  复旦大学附属中山医院
8. Distinct role of nuclear receptor corepressor 1 regulated de novo fatty acids synthesis in liver regeneration and hepatocarcinogenesis in mice. 2017, Hepatology (IF=13.246). 吉凯产品:RNAi慢病毒  研究领域:肝再生和肝癌  第二军医大学
9. SIRT1/HSF1/HSPs Pathway is Essential for Exenatide-alleviated Lipid-induced Hepatic Endoplasmic Reticulum Stress. 2017, Hepatology (IF=13.246). 吉凯产品:RNAi慢病毒  研究领域:肝脏内质网应激  中山大学附属第三医院
10. Loss of ERα induces amoeboid-like migration of breast cancer cells by downregulating vinculin. 2017, Nature Communications (IF=12.124). 吉凯产品:cas9慢病毒  研究领域:乳腺癌  空军军医大学(第四军医大学)

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