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细胞治疗综合服务

肿瘤新药靶IncRNA双细胞高级研究方案

基于TCGA大数据,分析验证未在所研究肿瘤中被报道过功能或临床相关性的新lncRNA功能基因,探讨其致病的分子机制,为后续抗肿瘤药物的靶点以及生物标记物的确定提供前期数据基础。

技术原理

长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA。越来越多的研究表明lncRNA在肿瘤的发生发展中起到了重要作用。通过TCGA大数据,分析出与生存期相关的lncRNA,通过吉凯基因疾病关键基因专利数据库,分析出在所研究肿瘤中没有报道过的候选lncRNA,利用慢病毒介导的RNAi技术,对若干个候选lncRNA分别进行RNAi,通过Cellomics高内涵功能筛选(HCS)平台(超链接至HCS界面)对感染后的细胞进行4~5天细胞计数,寻找到对细胞增殖有影响的目的lncRNA,通过FISH实验确定目的lncRNA的细胞内定位。并获得该lncRNA在两株细胞上的至少3个增殖方向功能学实验(MTT/细胞周期(PI/流式法)/凋亡(Annexin V/流式法)/BrdU/克隆形成等)以及2个转移方向功能学实验(划痕愈合/Transwell迁移/Transwell侵袭等)阳性结果。在动物水平研究中,进行裸鼠皮下成瘤或者尾静脉注射成瘤模型检测目的lncRNA的体内功能。在机制研究部分,构建目的lncRNA过表达以及对照稳定株,用生物素标记目的lncRNA后进行RNA-pulldown,跑胶切割差异条带进行LC-MS/MS测试分析,分析筛选目的lncRNA的互作蛋白,运用RIP实验验证互作蛋白与lncRNA的结合。对筛选到的阳性互作蛋白,构建干扰或过表达载体,在一株细胞株中干扰目的lncRNA的同时干扰或过表达阳性互作蛋白,通过HCS连续5天扫版观察细胞增殖能力的变化,验证下游机制基因对目的lncRNA的功能回复作用,并获得一个增殖相关和一个转移相关功能学实验的阳性回复实验结果。

结果展示

1. 初步筛选目的功能lncRNA:通过TCGA大数据,分析出与生存期相关的lncRNA,将候选lncRNA shRNA慢病毒感染靶细胞,使靶细胞内源表达的候选lncRNA表达下调,通过Cellomics高内涵功能筛选(HCS)平台(超链接至HCS界面)对感染后的细胞进行4~5天细胞计数,观察候选lncRNA表达下调后的细胞与对照细胞相比细胞增殖(或划痕愈合)的变化,从而推断对细胞增殖(转移)有影响的lncRNA。

注:最后提供一个阳性lncRNA@一株细胞的数据,含Negative Control(NC)和目的lncRNA RNAi两组结果。阴性基因数据不提供。

示例图:




2. 目的lncRNA细胞功能验证:用shRNA慢病毒在靶细胞中沉默目的lncRNA,qPCR验证目的基因在细胞中的敲减效率,用目的lncRNA探针FISH验证目的基因胞内定位,并在两株细胞上进行MTT/细胞周期(PI/流式法)/凋亡(Annexin V/流式法)/BrdU/克隆形成等增殖方向的功能学实验以及转移方向功能学实验(划痕愈合/Transwell迁移/Transwell侵袭等)。分组:NC vs KD,每组三个复孔。承诺在两株肿瘤靶细胞中该lncRNA敲减后的至少3个增殖方向(含HCS增殖检测)的功能学阳性实验结果或者2个转移方向(含HCS转移检测)的功能学阳性结果。

示例图—增殖方向实验:


示例图—转移方向实验:





3. 目的lncRNA体内功能验证:制备目的lncRNA敲低实验组或对照组成瘤细胞,注射裸鼠皮下或者尾静脉,构建裸鼠皮下成瘤模型或者尾静脉肿瘤转移模型,饲养裸鼠至瘤体长成,记录动物体重,瘤体大小曲线或进行活体成像,处死后收集瘤体称重,处理数据结果。

示例图:




4. lncRNA作用机制研究:构建lncRNA过表达载体以及对照载体;制备慢病毒,感染细胞,构建lncRNA过表达稳定株以及对照细胞株,qPCR检测过表达水平;用生物标记目的lncRNA,并进行RNA pull-down,切割目的组和对照组的差异条带,酶解提取肽段。将肽段样品分别进行LC-MS/MS测试分析,通过数据库检索完成蛋白的鉴定,并分析筛选候选互作蛋白。用候选互作基因抗体进行RIP验证目的lncRNA与互作蛋白的结合。

示例图:




5. 根据实验4中RNA pull-down和RIP结果选择一个阳性互作蛋白,构建携带红色荧光的干扰或过表达载体,在一株细胞株中干扰目的lncRNA(感染携带绿色荧光的干扰慢病毒)的同时干扰或过表达阳性互作蛋白(感染携带红色荧光的干扰或过表达慢病毒),通过HCS连续5天扫版观察黄色荧光细胞增殖能力的变化,验证下游机制基因对目的lncRNA的功能回复作用,并获得一个增殖相关和一个转移相关功能学实验的阳性回复实验结果,实验分组:NC(目的lncRNA)+NC(下游机制基因);KD(目的lncRNA)+NC(下游机制基因);KD(目的lncRNA)+OE/KD(下游机制基因)。

研究技术路线

参考文献

1.Wang et al. Long noncoding RNA EGFR-AS1 promotes cell growth and metastasis via affecting HuR mediated mRNA stability of EGFR in renal cancer. Cell Death Dis. 2019;10(3):154.

2.et al. The long non-coding RNA Linc-GALH promotes hepatocellular carcinoma metastasis via epigenetically regulating Gankyrin. Cell Death Dis. 2019;10(2):86.

3.Li et al. X chromosome-linked long noncoding RNAlnc-XLEC1 regulates c-Myc-dependent cell growth by collaborating with MBP-1 in endometrial cancer. Int J Cancer. 2019;doi: 10.1002.

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