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细胞治疗综合服务

肿瘤新药靶Genecard双靶点研究方案

基于TCGA大数据,分析验证未在所研究肿瘤中被报道过功能或临床相关性的新功能基因,探讨其致病的分子机制,为后续抗肿瘤药物的靶点以及生物标记物的确定提供前期数据基础。

技术原理

通过TCGA大数据,分析出在癌组织中高表达或者表达与疾病分期分级相关的基因,通过吉凯基因疾病关键基因专利数据库,分析出在所研究肿瘤中没有报道过的候选基因,利用慢病毒介导的RNAi技术,对若干个候选基因分别进行RNAi,通过Cellomics高内涵功能筛选(HCS)平台,对感染后的细胞进行4~5天细胞计数,寻找到对细胞增殖有影响的基因。并获得针对该基因的两个干扰靶点在一株细胞上的至少3个增殖方向功能学实验(MTT/细胞周期(PI/流式法)/凋亡(Annexin V/流式法)/BrdU/克隆形成等)以及2个转移方向功能学实验(划痕愈合/Transwell迁移/Transwell侵袭等)阳性结果。在一株细胞株上对目的基因进行干扰后,进行转移相关经典通路组合panel*的WB验证。根据WB panel结果选择一个阳性机制基因,构建该机制基因干扰或过表达病毒,在细胞株上干扰目的基因的同时干扰或过表达下游机制基因,通过HCS连续5天扫版观察细胞增殖能力的变化,验证下游机制基因对目的基因的功能回复作用,并获得一个增殖相关和一个转移相关功能学实验的阳性回复实验结果。


*转移相关经典通路组合panel:AKT1、p-AKT(Ser473 or Thr308)、mTOR、p-mTOR(Ser2448)、ERK1/2、p-ERK1/2(Thr202+Tyr204)、P38、p-P38(T180+Y182)、MYC、β-Catenin、p-β-Catenin(S33+S37)、NFkB-p65、p-NFkB-p65(Ser536)、CDH1(E-Cadherin)、CDH2(N-Cadherin)、MMP2、MMP9、FN1、VIM、Snail、Slug、TWIST等22个基因。

结果展示

1. 初步筛选目的功能基因:通过TCGA大数据,分析出在癌组织中高表达或者表达与疾病分期分级相关的基因,将候选基因shRNA慢病毒感染靶细胞,使靶细胞内源表达的候选基因表达下调,通过Cellomics高内涵功能筛选(HCS)平台,对感染后的细胞进行4~5天细胞计数,观察候选基因表达下调后的细胞与对照细胞相比细胞增殖(或划痕愈合)的变化,从而推断对细胞增殖(转移)有影响的基因。

注:最后提供一个阳性基因@一株细胞的数据,含Negative Control(NC)和目的基因RNAi两组结果。阴性基因数据不提供。

示例图:





2. 目的基因细胞功能验证:分别用针对目的基因的两个shRNA慢病毒在靶细胞中沉默目的基因,qPCR和WB验证两个干扰靶点的敲减效率,并在一株细胞上进行MTT/细胞周期(PI/流式法)/凋亡(Annexin V/流式法)/BrdU/克隆形成等增殖方向的功能学实验以及转移方向功能学实验(划痕愈合/Transwell迁移/Transwell侵袭等)。分组:NC vs KD1 vs KD2,每组三个复孔。承诺两个干扰靶点在一株肿瘤靶细胞中该基因敲减后的至少3个增殖方向(含HCS增殖检测)的功能学阳性实验结果或者2个转移方向(含HCS转移检测)的功能学阳性结果。

示例图—增殖方向实验:


示例图—转移方向实验:






3. 目的基因下游机制分子检测:在一株细胞中对目的基因进行干扰,抽提细胞蛋白,与对照组相比进行转移相关的经典基因panel的WB检测,分析下游分子机制。

示例图:




4. 下游机制分子与目的基因的功能回复验证:根据实验3中WB panel结果选择一个阳性机制基因,构建该机制基因干扰或过表达病毒(携带红色荧光),在细胞株上干扰目的基因(感染携带绿色荧光的干扰慢病毒)的同时干扰或过表达下游机制基因(感染携带红色荧光的干扰或过表达慢病毒),通过HCS连续5天扫版观察黄色荧光细胞增殖能力的变化,验证下游机制基因对目的基因的功能回复作用,并获得一个增殖相关和一个转移相关功能学实验的阳性回复实验结果,实验分组:NC(目的基因)+NC(下游机制基因);KD(目的基因)+NC(下游机制基因);KD(目的基因)+KD/OE(下游机制基因)。

研究技术路线

参考文献

1.Zheng et al. FAM98A promotes proliferation of non-small cell lung cancer cells via the P38-ATF2 signaling pathway. Cancer Manag Res. 2018;10:2269-2278.

2.Xiong et al. TRIM44 promotes human esophageal cancer progression via the AKT/mTOR pathway. Cancer Sci. 2018;109(10):3080-3092.

3.Liu et al. TRIM59 overexpression correlates with poor prognosis and contributes to breast cancer progression through AKT signaling pathway. Mol Carcinog. 2018;57(12):1792-1802.

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