细胞治疗综合服务

全基因组CAS9筛选

使用CAS9全基因组敲除文库结合高通量测序以及生物信息学分析筛选不同处理因素(如抗肿瘤药物缺氧压力等)处理下的耐受敏感相关关键基因集的服务。对筛选出的关键增敏基因进行功能验证以及机制分析,为后续抗肿瘤药物增敏靶点的确定提供前期数据。

技术原理

吉凯的CRISPR/Cas9-sgRNA(single guide RNA)全基因组文库CRISPR-PoolTMKOUT是基因组范围的CRISPR敲除文库,可在人基因组内敲除任何编码基因和部分miRNA。文库含有针对每个编码基因的6个sgRNA和针对每个miRNA的4个sgRNA,以及1000个非靶向性的对照sgRNA。
为筛选到可增加细胞对目的药物(或目的处理因素)敏感性的增敏基因,应用CAS9全基因组敲除文库慢病毒感染细胞,使用puromycin筛选。文库感染成功后,加入目的药物进行或进行其他条件处理,在不同时间点收集细胞,抽提基因组DNA,使用sgRNA设计的通用引物扩增,高通量测序检测sgRNA组份,根据不同时间点收集细胞样本sgRNA富集度排序获得候选增敏基因。候选基因筛选原则:基因的缺失本身对于细胞增殖无明显影响,与药物共同作用时对细胞增殖有显著的抑制作用,可能作为潜在的化疗药物增敏靶点。针对获得的候选增敏基因,结合吉凯基因疾病关键基因专利数据库和高内涵功能基因筛选平台(HCS)筛选出在所研究肿瘤中没有报道过的,并能显著增加细胞对药物敏感性的基因,完成该基因在给药以及不给药处理下对细胞增殖、凋亡、周期、克隆形成等的影响,阐明该基因发挥功能的分子机制。

结果展示

预实验阶段:构建文库病毒,对细胞进行支原体检测以及细胞生长曲线检测,确认目的细胞株是否适用于文库筛选。对细胞进行puromycin预实验以及文库病毒低MOI感染预实验,确定文库筛选时所使用的MOI值。通过药物IC50测定和长时间加药处理检测细胞增殖确定文库筛选时药物处理浓度。

示例图:





CAS9文库筛选及测序鉴定:目的细胞系培养后感染cas9文库慢病毒,使用puromycin筛选,7天后剩余细胞为成功感染细胞,细胞数量在107以上。加入药物,后每两天计数,与对照组对比,在短时间点和长时间点分别收取细胞样本。收取细胞样本抽提基因组DNA,使用sgRNA设计的通用引物扩增,高通量测序检测sgRNA组份,根据短时间和长时间收集细胞样本sgRNA富集度排序获得候选增敏相关基因。候选基因筛选原则:基因的缺失本身对于细胞增殖无明显影响,与药物共同作用时对细胞增殖有显著的抑制作用,可能作为潜在的化疗药物增敏靶点。有效的增敏相关基因敲除会在药物处理短时间收集的细胞样本中表现出一定的下降,并在长时间收集的细胞样本中表现出更大程度的下降。对筛选到的候选增敏基因集进行GO、KEGG/Pathway分析。

示例图:




初步筛选增敏基因:挑选20个候选基因,使用单个基因的sgRNA慢病毒分别感染靶细胞,每个基因3个复孔,通过Cellomics高内涵功能筛选(HCS)平台,对感染后的细胞进行4~5天细胞计数,观察候选基因敲除后的细胞分别在药物处理以及对照处理条件与对照组相比细胞增殖的变化,初步筛选到约3-5个对细胞增殖有影响的基因,并确定该基因单个sgRNA的敲除效率。




对筛选到1-3个功能阳性基因进行完整的细胞功能学研究:在肿瘤细胞株上敲除目的基因后进行给药或不给药,并进行MTT/细胞周期(PI/流式法)/凋亡(Annexin V/流式法)/BrdU/克隆形成等增殖方向的功能学实验。分组:NC vs KD,加药以及不加药(或刺激以及不刺激),每组三个复孔。
示例图:




目的基因作用机制研究:通过全基因表达谱芯片检测目的基因敲除组细胞在给药或不给药处理下的差异基因,对差异基因进行IPA生信分析,并进行qPCR,分析目的基因下游通路。

示例图:

研究技术路线

参考文献

1.Ophir Shalem et al.Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Science 343, 84 (2014);DOI: 10.1126/science.1247005.

2.Tzelepis et al. CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia.  Cell Reports. 2016;17, 1193–1205A.

3.Patel et al. Identification of essential genes for cancer immunotherapy. Nature. 2017;548(7669):537-542.

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