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细胞治疗综合服务

肿瘤新药靶Genecard双靶点高级研究方案

基于TCGA大数据,分析验证未在所研究肿瘤中被报道过功能或临床相关性的新功能基因,深入探讨其致病的分子机制,为后续抗肿瘤药物的靶点以及生物标记物的确定提供前期数据基础。

技术原理

通过TCGA大数据,分析出与生存期相关的基因,通过吉凯基因疾病关键基因专利数据库,分析出在所研究肿瘤中没有报道过的候选基因,利用慢病毒介导的RNAi技术,对若干个候选基因分别进行RNAi,通过Cellomics高内涵功能筛选(HCS)平台,对感染后的细胞进行4~5天细胞计数,寻找到对细胞增殖有影响的基因。并获得针对该基因的两个干扰靶点在一株细胞上的至少3个增殖方向功能学实验(MTT/细胞周期(PI/流式法)/凋亡(Annexin V/流式法)/BrdU/克隆形成等)以及2个转移方向功能学实验(划痕愈合/Transwell迁移/Transwell侵袭等)阳性结果。在动物水平研究中,进行裸鼠皮下成瘤或者尾静脉注射成瘤模型检测目的基因的体内功能。在机制研究部分,运用co-IP质谱方法筛选目的基因互作蛋白,通过构建在目的基因(bait)的N端融合3×FLAG标签(3×FLAG-bait)的过表达慢病毒,筛选过表达稳定株以及对照稳定株,收集细胞蛋白,用Anti-Flag抗体进行IP,跑胶切割条带后提取肽段进行LC-MS/MS测试分析,分析筛选互作蛋白,进一步通过候选互作蛋白的特异性抗体进行co-IP结合验证;对筛选到的阳性互作蛋白,构建的干扰或过表达载体,在一株细胞株中干扰目的基因的同时干扰或过表达阳性互作蛋白,通过HCS连续5天扫版观察细胞增殖能力的变化,验证下游机制基因对目的基因的功能回复作用,并获得一个增殖相关和一个转移相关功能学实验的阳性回复实验结果。

结果展示

1. 初步筛选目的功能基因:通过TCGA大数据,分析出与生存期相关的基因,将候选基因shRNA慢病毒感染靶细胞,使靶细胞内源表达的候选基因表达下调,通过Cellomics高内涵功能筛选(HCS)平台,对感染后的细胞进行4~5天细胞计数,观察候选基因表达下调后的细胞与对照细胞相比细胞增殖(或划痕愈合)的变化,从而推断对细胞增殖(转移)有影响的基因。

注:最后提供一个阳性基因@一株细胞的数据,含Negative Control(NC)和目的基因RNAi两组结果。阴性基因数据不提供。

示例图:





2. 目的基因细胞功能验证:分别用针对目的基因的两个shRNA慢病毒在靶细胞中沉默目的基因,qPCR和WB验证两个干扰靶点的敲减效率,并在一株细胞上进行MTT/细胞周期(PI/流式法)/凋亡(Annexin V/流式法)/BrdU/克隆形成等增殖方向的功能学实验以及转移方向功能学实验(划痕愈合/Transwell迁移/Transwell侵袭等)。分组:NC vs KD1 vs KD2,每组三个复孔。承诺两个干扰靶点在一株肿瘤靶细胞中该基因敲减后的至少3个增殖方向(含HCS增殖检测)的功能学阳性实验结果或者2个转移方向(含HCS转移检测)的功能学阳性结果。


示例图—增殖方向实验:




示例图—转移方向实验:




3. 目的基因体内功能验证:制备目的基因敲低实验组或对照组成瘤细胞,注射裸鼠皮下或者尾静脉,构建裸鼠皮下成瘤模型或者尾静脉肿瘤转移模型,饲养裸鼠至瘤体长成,记录动物体重,瘤体大小曲线或进行活体成像,处死后收集瘤体称重,处理数据结果。

示例图:




4. 目的基因作用机制研究:运用co-IP质谱方法筛选目的基因互作蛋白,通过构建在目的基因(bait)的N端融合3×FLAG标签(3×FLAG-bait)的载体,制备慢病毒,感染细胞,筛选过表达稳定株以及对照稳定株,收集细胞蛋白,用Anti-Flag抗体进行IP,SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色,与对照组相比切割目的组差异条带,酶解提取肽段进行LC-MS/MS测试分析,通过数据库检索完成蛋白的鉴定,分析筛选互作蛋白,进一步通过候选互作蛋白的特异性抗体进行co-IP结合验证。

示例图:




5. 阳性互作基因与目的基因功能回复验证:对筛选到的阳性互作蛋白,构建携带红色荧光的干扰或过表达载体,在一株细胞株中干扰目的基因(感染携带绿色荧光的干扰慢病毒)的同时干扰或过表达阳性互作蛋白(感染携带红色荧光的干扰或过表达慢病毒),通过HCS连续5天扫版观察黄色荧光细胞增殖能力的变化,验证下游机制基因对目的基因的功能回复作用,并获得一个增殖相关和一个转移相关功能学实验的阳性回复实验结果,实验分组:NC(目的基因)+NC(下游机制基因);KD(目的基因)+NC(下游机制基因);KD(目的基因)+OE/KD(下游机制基因)。

研究技术路线

参考文献

1.Lu et al. RUNX2 Plays An Oncogenic Role in Esophageal Carcinoma by Activating the PI3K/AKT and ERK Signaling Pathways. Cell Physiol Biochem. 2018; 49(1):217-225.

2.Yang et al. TRIM52 plays an oncogenic role in ovarian cancer associated with NF-kB pathway. Cell Death and Disease. 2018; 57(12):1792-1802.

3.Chen et al. HJURP promotes hepatocellular carcinoma proliferation by destabilizing p21 via the MAPK/ERK1/2 and AKT/GSK3β signaling pathways. J Exp Clin Cancer Res. 2018;37(1):193.

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