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细胞治疗综合服务

Genecard plus

基于TCGA、GEO大数据或客户样本,对所筛选到的新功能基因进行细胞、体内水平以及分子机制的多种实验验证,为后续抗肿瘤药物的靶点以及生物标记物的确定提供前期数据基础。

技术原理

通过在肿瘤细胞株、动物水平验证目的基因功能,并从下游分子探讨、互作蛋白筛选、DNA甲基化检测、乙酰化、泛素化、自噬、干性、衰老等热点机制研究方向探讨目的基因的分子机制。

实验内容


1、 CRISPR-CAS9敲除目的基因进行功能验证:构建sgRNA以及CAS9慢病毒感染目的细胞,通过错配酶法筛选敲除靶点,WB验证敲除效率,从MTT、BrdU、EDU、细胞凋亡、caspase3/7活性检测、增殖或凋亡marker WB检测、克隆形成、细胞周期等增殖相关功能学实验或者划痕愈合、Transwell迁移、Transwell侵袭等转移相关实验中选择相应的实验进行验证。

2、 目的基因动物体内水平功能验证:制备目的基因敲减成瘤细胞和对照组成瘤细胞,进行裸鼠皮下成瘤模型或者尾静脉注射成瘤模型构建,通过测量瘤体体积或者活体成像,记录瘤体生长曲线,待瘤体长到一定程度,处死小鼠,取瘤体组织,测量收集并分析数据。

3、 下游分子机制研究1:通过全基因表达谱芯片检测目的基因敲减组细胞和对照组细胞下游差异基因,对差异基因进行IPA生信分析,并进行qPCR和WB验证,分析目的基因下游通路。

4、 下游分子机制研究2:在肿瘤细胞株中对目的基因敲减后,选择增殖或转移相关的经典通路分子panel进行WB检测,分析目的基因下游经典分子机制。

5、 目的基因互作蛋白筛选:通过co-IP质谱筛选互作蛋白,构建在目的基因(bait)的N端融合3×FLAG标签(3×FLAG-bait)的载体,制备慢病毒,感染细胞,筛选过表达稳定株以及对照稳定株,收集细胞蛋白,用Anti-Flag抗体进行IP,SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色,与对照组相比切割目的组差异条带,酶解提取肽段进行LC-MS/MS测试分析,通过数据库检索完成蛋白的鉴定,分析筛选互作蛋白,进一步通过候选互作蛋白的特异性抗体进行co-IP结合验证。

6、 目的基因细胞内定位:通过免疫荧光检测目的基因在细胞内的分布情况。

7、DNA甲基化方向机制研究:

7.1、针对目的基因的甲基化检测:对目的基因进行CpG岛分析,确认CpG岛数目,在客户提供的临床样本中进行亚硫酸氢盐扩增子测序法(BSAS)实验,检测目的基因的甲基化修饰差异情况。

7.2、针对目的基因下游甲基化方向机制研究:qPCR和WB检测在目的基因敲减的条件下,DNA甲基化转移酶(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)或DNA甲基化羟化酶(Tet1、Tet2、Tet3)的表达变化。

8、乙酰化方向机制研究:

8.1、目的机制分子乙酰化检测:根据目的基因前期实验或参考文献,挑选候选下游机制基因,通过候选下游机制基因的特定位点乙酰化抗体,WB检测在目的基因敲减的条件下,候选下游机制基因的乙酰化差异情况。

8.2、机制分子泛乙酰化检测:根据目的基因前期实验或参考文献,挑选候选下游机制基因,通过候选机制基因IP抗体,IP后用泛乙酰化抗体进行WB检测。

9、泛素化机制方向研究

9.1、间接目的机制分子乙酰化检测:根据目的基因前期实验或参考文献,选择候选泛素化酶以及该泛素化酶下游经典靶分子,WB检测在目的基因敲减的条件下泛素化酶以及该泛素化酶下游经典靶分子的表达差异。

9.2、下游机制分子泛素化检测:根据目的基因前期实验或参考文献,挑选候选下游机制基因,通过候选机制基因IP抗体,IP后用泛素化抗体进行WB检测。

10、自噬机制方向研究:

10.1、自噬水平检测:在目的基因敲减的条件下,WB检测待检测的自噬相关蛋白(LC3I/II,P62,BECN(beclin-1))表达差异情况。或构建LC3双荧光慢病毒,与目的基因敲减慢病毒进行共感染,通过CQ1进行荧光变化检测,分析自噬流变化。

10.2、自噬经典通路机制分子检测:选择经典的自噬相关通路分子,如ATG7/ATG3/mTOR/p-mTOR/AMPK/p-AMPK/ULK1/p-ULK1,WB检测在目的基因敲减条件下待检测自噬相关蛋白表达差异情况。

11、干性机制方向研究:通过3D培养干细胞成球实验,检测目的基因敲减对肿瘤细胞干性的影响;并通过免疫流式荧光检测目的基因敲减条件下几个肿瘤干细胞的marker的表达差异。

12、衰老机制方向研究:通过SA-b-gal 染色,探索目的基因敲减对衰老的影响;通过qPCR检测目的基因敲减条件下几个衰老相关的marker的表达差异。


参考文献

1.ZMYND8 acetylation mediates HIF-dependent breast cancer progression and metastasis. Chen Y, et al. J Clin Invest. 2018.

2.miRNA-mediated TUSC3 deficiency enhances UPR and ERAD to promote metastatic potential of NSCLC. Jeon YJ et al.  Nat Commun. 2018 Nov 30;9(1):5110.

3.MIR93 (microRNA -93) regulates tumorigenicity and therapy response of glioblastoma by targeting autophagy. Huang T, et al. Autophagy. 2019 Jun;15(6):1100-1111.

4.TSPAN15 interacts with BTRC to promote oesophageal squamous cell carcinoma metastasis via activating NF-κB signaling. Zhang B, et al. Nat Commun. 2018 Apr 12;9(1):1423.

5.Enhancer hijacking activates oncogenic transcription factor NR4A3 in acinic cell carcinomas of the salivary glands. Haller F, et al. Nat Commun. 2019 Jan 21;10(1):368.

6.Novel identification of STAT1 as a crucial mediator of ETV6-NTRK3-induced tumorigenesis. Park J. Oncogene. 2018 Apr;37(17):2270-2284.

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