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CRISPR/Cas9基因敲除细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行目的基因敲除细胞系的构建。

技术原理

CRISPR/Cas9通过对靶DNA序列进行切割,利用细胞的非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)修复机制在DNA切割处随机产生Indels突变,从而导致编码基因读码框发生改变,产生功能缺失的蛋白,达到对该基因进行敲除的目的。通过对CRISPR/Cas9转染的细胞进行单克隆分离培养后测序,可以筛选出目的基因有效敲除的单克隆细胞株进行后续科研实验。


CRISPR/Cas9分为Cas9和gRNA两部分,Cas9为核酸内切酶,负责切割DNA;gRNA由scaffold和spacer两部分构成,scaffold负责结合并激活Cas9,spacer长度在20bp左右,通过设计成和目的序列互补序列后,可引导Cas9靶向切割目的DNA序列。

结果展示

CRISPR/Cas9  基因敲除细胞株构建流程


将sgRNA克隆至表达质粒并转染293T细胞,72h后分选阳性细胞,抽提基因组DNA,进行T7E1检测,筛选切割效率最高的5’sgRNA-3用于后续质粒构建。


质粒转染细胞,72小时后通过荧光标签将阳性细胞分选至96孔板中进行单克隆培养。



单克隆株PCR鉴定:针对目的基因序列设计基因型鉴定引物,正反向引物设计在敲除片段两端,Control组通过PCR能够扩增出1065bp的片段,基因敲除组通过PCR能够扩增出219bp的片段。


将PCR鉴定正确的样品进一步进行测序鉴定

参考文献

1.RNA-guided human genome engineering via Cas9. 2013. Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM. Science. 339(6121):823-6.

2.Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. 2013. Qi LS, Larson MH, Gilbert LA, Doudna JA, Weissman JS, Arkin AP, Lim WA. Cell. 152(5):1173-83.

3.Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. 2013. Ran FA, Hsu PD, Wright J, Agarwala V, Scott DA, Zhang F. Nat Protoc. 8(11):2281-308.

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