心血管领域

心血管疾病是当今威胁人类最严重的疾病之一。使用工具病毒对心血管疾病特定基因进行定向和组织特异性的改造,将为心血管研究提供强大工具。

常用模型

心血管领域常用模型

常在提取的原代心肌细胞或者血管平滑肌细胞上,构建心血管疾病细胞模型,例如缺血缺氧模型。一些更高级别的文章,则会在细胞模型的基础上,进一步利用动物实验进行更严谨的在体水平验证。下面是心血管系统常见的一些细胞模型。



参考文献

1. X Yan, J Tian, H Wu, et al. Ginsenoside rb1 protects neonatal rat cardiomyocytes from hypoxia/ischemia induced apoptosis and inhibits activation of the mitochondrial apoptotic pathway. Evidence-Based Complementray and Alternative, 2014, 2014(2): 149195.

2. Y Fujio, T Nguyen, D Wencker, et al. Akt promotes survival of cardiomyocytes in vitro and protects against ischemia-reperfusion injury in mouse heart. Circulation, 2000, 101 (6): 660-667.

3. X Long, MJ Goldenthal, GM Wu, et al. Mitochondrial Ca2+flux and respiratory enzyme activity decline are early events in cardiomyocyte response to H2O2. Journal of Molecular & Cellular Cardiology, 2004, 37(1): 63-70.

工具病毒选择指南

心血管系统研究如何挑选合适的工具病毒

慢病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV)等都是常用的工具病毒载体,在心血管系统的研究中该如何选择呢?

1.  慢病毒:慢病毒的优点是可以将靶基因整合入宿主的基因组中持续稳定的表达,引起的免疫反应较为温和。但是其缺点是在体注射时,对心血管系统的细胞(特别是心肌细胞)缺乏特异性的趋向性,实验者往往需要通过心肌注射的方法来实现心肌细胞的转染,而开胸实验的难度较大,易导致动物死亡,因此影响其广泛应用。

2.  腺病毒:许多心血管疾病的研究会使用腺病毒载体进行,因为腺病毒对心肌细胞的感染效果较好,并且靶基因的表达效果较好。但其表达是瞬时的(一般在心肌细胞中可持续1-4周),且易引起较强烈的免疫反应,严重时可导致实验动物死亡。

3.  腺相关病毒AAV:与腺病毒相比,AAV对心肌细胞具有更高的感染效率。运用AAV载体的另一个显著优点是有些AAV血清型,如AAV1、AAV6、AAV8和AAV9等对于心肌细胞具有较高的趋向性,可直接静脉注射感染,不需要复杂危险的开胸手术,因此现有的Ⅱ期临床试验,均使用AAV。点击了解更多AAV血清型选择小窍门>>


AAV 血清型的趋向性




了解了这些病毒载体在心血管系统应用中的优势和不足后,如何根据具体的实验需求和基因情况选择合适的病毒载体呢?我们需要考虑这几个方面:

1.  工具载体的表达时间与实验观察时间是否相符;

2.  工具载体可以容纳的片段大小与目的基因大小是否契合;

3.  工具载体对目的细胞、在体组织的转导是否足够高效。


下表总结了常用基因操作工具的选择方法:





吉凯小建议:

1.  在体实验建议选择腺相关病毒,它具有滴度高,扩散效果好,免疫原性低等特点。且AAV 1/6/8/9等血清型对心脏均具有较好的亲和性,可直接尾静脉注射感染心脏,不需要复杂危险的开胸手术。

2.  心肌细胞体外感染建议选择慢病毒或腺病毒:慢病毒在感染原代心肌细胞后2-4 天开始表达,且对心肌细胞的毒性低、损伤小;腺病毒在感染原代心肌细胞后1-2天开始表达,感染效率高,表达快。

3.  如需目的基因在心肌或平滑肌细胞中特异性表达,可使用特异性启动子,如心肌细胞特异性启动子cTnT、心肌细胞早期特异性启动子mNkx2.5及平滑肌细胞特异性启动子SM22a。吉凯提供组织特异性启动子载体的病毒包装服务,点击了解>>

注射方法

心血管系统病毒注射方法

工具病毒在心血管系统的注射方法总体上包括静脉注射、心腔内注射、心肌内定点注射、心包内注射(介于心肌与心包膜之间),其中静脉注射包括尾静脉注射、颈静脉注射、面部静脉注射等。其中最常用的是心肌定点注射和尾静脉注射病毒的方法。



1. 颈静脉注射、心腔内注射、心肌内定(多)点注射、心包内注射

心腔内注射需要结合主动脉嵌夹进行,由于开胸腔手术需要辅助呼吸,对手术操作要求较高。注射体积约为20μL 左右。心肌内定点注射时,使用 27-29G 的针头,每点注射约 2-5μL,注意缓慢注射,病毒在注射的局部点附近感染较好,扩散有限。
2. 尾静脉注射感染
由于心脏血流快等原因,尾静脉注射的病毒不容易富集在心脏,因此相比其他器官,尾静脉注射需要更大的病毒量。




实验操作方法
下面以大鼠气管切开插管,心肌定点注射病毒为例做详细介绍:
a. 固定大鼠仰卧于手术台上。剪除颈部及胸部被毛。

b. 纵形剪开颈部皮肤1.5~2cm,分离皮下组织及肌肉,并显露其上甲状腺腺体。

c. 于腺体后方钝性分离气管并带线,注意勿损伤腺体及血管,提起丝线,剪刀于气管环之间剪开气管半周。

d. 行气管插管,接呼吸机。调整呼吸频率、吸呼比及潮气量(常见潮气量为2~3 ml /次,呼吸频率为60次/min,呼吸比为1∶1.5,需要根据呼吸机使用指南及大鼠表现调节)。

e. 胸骨左缘3 mm纵形剪开胸部皮肤约4 cm。钝性分离皮下、胸大肌与前锯肌。第三肋间逐步剪开肋间肌,显露胸膜。

f. 找准进入位点,一般是在心跳明显处,用镊子于呼气时刺破胸膜,进入胸腔。撑开肋骨,撕破心包,显露心脏。必要时可于左外侧垫纱布隔开左肺。

g. 在心肌表面,注射病毒,可以以心脏长轴距离心尖0.5 mm处为中心,在其上下左右2 mm处分四点于心肌内注射病毒,注射成功后可见局部颜色由红色转为白色,也可以根据想要标记的肌肉大小进行调整,一般都选择多点注射病毒,病毒扩散效果比较好。病毒注射以后,探查无出血后关胸,注意勿缝到心肺及血管。在缝合过程中胸腔留置吸引管一根,其他部分的肌肉皮肤进行逐层缝合。

h. 在缝合完毕以后,针筒抽吸胸腔积气积液,并拔除吸引管。

i. 大鼠苏醒后,待其状态良好,拔除气管插管,停止人工呼吸,清除气道血块及分泌物,进行一针缝合气管及肌肉切口,并将小鼠放回鼠笼常规喂养。




注意事项

a. 如果经口插管建立辅助呼吸,那么气管插管次数不宜太多,因插管次数太多易致喉水肿而窒息死亡,插管时用小镊子拉出鼠舌,顺舌根插成功率较高,插管后接呼吸机,若小鼠胸廓起伏与呼吸机频率一致,提示插管成功。

b. 心肌定点注射病毒时,注意排空注射器内空气,以免造成空气栓塞导致小鼠死亡。

c. 由于小鼠心肌比较薄,故注射液体时注射器针头不能刺入太深以防注入心腔。



更多工具病毒体内注射实验操作视频,点击查看>>


用量参考

心血管系统病毒用量参考

以下表格中为吉凯客户应用文献总结(部分)。更多心血管系统病毒注射参数,点击查看与下载>>


1. 慢病毒




代表文献 Circulation,2016:CIRCULATIONAHA.116.017949.






2. 腺病毒



代表文献 吉凯客户文章Cardiovascular research,2014:cvu007.





3. 腺相关病毒



代表文献


引用文献

1. Simvastatin alleviates cardiac fibrosis induced by infarction via up‐regulation of TGF‐β receptor III expression[J]. 2015, British journal of pharmacology (IF= 6.81).  吉凯产品:慢病毒  研究领域:心脏纤维化  哈尔滨医科大学
2. Deletion of sirtuin 6 accelerates endothelial dysfunction and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice[J]. 2016, Translational Research (IF= 4.88).  吉凯产品:慢病毒  研究领域:动脉粥样硬化  中山大学
3. The sirtuin 6 prevents angiotensin II-mediated myocardial fibrosis and injury by targeting AMPK-ACE2 signaling[J]. 2017, Oncotarget.   吉凯产品:腺相关病毒  研究领域:心肌纤维化  上海交通大学附属瑞金医院
4. MiR-101 inhibited post-infarct cardiac fibrosis and improved left ventricular compliance via FOS/TGFβ1 pathway[J]. 2012,Circulation (IF= 18.881).   吉凯产品:腺病毒  研究领域:心脏纤维化  哈尔滨医科大学
5. In vitro and in vivo direct monitoring of miRNA-22 expression in isoproterenol-induced cardiac hypertrophy by bioluminescence imaging[J]. 2014, European journal of nuclear medicine and molecular imaging (IF= 7.704).   吉凯产品:腺病毒  研究领域:心脏肥大  哈尔滨医科大学第四附属医院
6. Silencing of Pellino1 improves postinfarct cardiac dysfunction and attenuates left ventricular remodeling in mice[J]. 2014, Cardiovascular research (IF= 6.290).   吉凯产品:腺病毒  研究领域:心肌梗死  南京医科大学
7. α-Enolase plays a catalytically independent role in doxorubicin-induced cardiomyocyte apoptosis and mitochondrial dysfunction[J]. 2015, Journal of molecular and cellular cardiology (IF= 5.296).   吉凯产品:腺病毒  研究领域:心肌细胞凋亡和线粒体功能障碍  中山大学

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