非编码基因

非编码RNANon-coding RNA)是指不能翻译为蛋白的功能性RNA分子。常见的具有调控作用的非编码RNA包括siRNAmiRNApiRNAcircRNA以及长链非编码RNAlncRNA)。越来越多的实验数据证明它们在基因沉默、细胞分化、蛋白合成与功能调节、代谢调控、器官发育等众多生物学过程中起调控作用。

LncRNA

lncRNA是长度大于200bp的RNA,具有保守的二级结构,可与蛋白、DNA和RNA相互作用,参与调控多种生物学过程,如肿瘤发生、表观遗传、转录及转录后调控等。起初lncRNA被认为是基因组转录的“噪音”,是RNA聚合酶II转录的副产物,不具有生物学功能 。然而,1991年,Nature等杂志刊文(Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome)报道了Xist参与X染色体失活的调控,此后越来越多研究表明,lncRNA在众多生命活动过程中发挥重要作用,同时二代测序技术的发展,使得lncRNA备受关注,成为研究热点。

LncRNA产品与载体

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miRNA

miRNA,又称microRNA,是指一类由内源基因编码的长度约为22nt 的非编码单链RNA分子,由细胞内源产生的发卡结构转录本加工而来。miRNA通过其种子序列(5‘ 端第2-8位核苷酸)识别靶基因mRNA 3’UTR上的结合位点,携带RISCRNA诱导沉默复合体,RNA-induced silencing complexRISC)发挥对靶基因的抑制作用。




miRNA的调控方式

1.  miRNA-up

miRNA的过表达载体中有插入成熟miRNA、pre-miRNA及pri-miRNA序列三种形式。其中pri-miRNA(含侧翼序列)的方式由于保留了每个microRNA独自的原始天然双臂结构,效果更好,是应用最为广泛的方法。

2. miRNA-down

miRNA-down载体转录后表达的miRNA抑制剂(miArrest)可高效、特异地结合细胞内成熟的靶miRNA,形成稳定的复合物,阻止了miRNA对靶标mRNA的降解或者翻译抑制,上调miRNA靶标基因的表达。独特的载体设计确保最大程度抑制强度、抑制持久性和特异性,同时将脱靶效应降至最低。




如何进行miRNA靶基因预测及验证


1. miRNA靶基因预测

miRNA通过靶向调控基因(如编码基因、lncRNA等)发挥调控作用。miRNA和靶基因的作用模式相对简单,许多权威的数据库就可以进行miRNA与靶基因的结合位点预测。


1.1  miRNA与编码基因的结合位点预测:如targetscan,miranda,miRDB等数据库就可以进行miRNA与编码基因的结合位点预测。

1.2  miRNA与lncRNA的结合位点预测:如starbase、mircode、BiBiServ2-RNAhybrid等数据库。starbase可以直接预测miRNA与lncRNA的结合位点,只需要选择对应的microRNA和对应的lncRNA即可。mircode在对应的位置输入基因名称和miRNA家族即可进行预测。BiBiServ2-RNAhybrid网站可以通过提交一段序列和一个或者多个miRNA进行结合位点预测。


2. miRNA靶基因验证

通过使用免费数据库预测出感兴趣的miRNA可能与哪些靶基因结合,随后就是用实验方法验证预测结果了,可以使用荧光素酶报告基因检测方法或者也可直接检测miRNA过表达或下调表达后,靶基因在mRNA(qRT-PCR方法)或蛋白水平上的变化(Western Blot方法)。下面以荧光素酶报告基因检测方法为例做简要说明:


2.1  如何判断实验体系无异常,获得客观的实验结果?可以从以下几个方面来考察实验结果的客观性:

· 对照的2个实验组,即实验组1与实验组2 luc表达情况应无显著差异;

· 转染正常,质粒或mimic确保成功转染入细胞;

· luc检测值在仪器检测线性范围内。


2.2  转染成功如何判断?

共转染的几个质粒中,3' UTR质粒及Renilla质粒可通过最终的luc读值判断是否转染成功,而miRNA质粒或mimic的转染情况无法从最终的luc读值做出判断,因而针对miRNA,转染是否成功可用以下方法进行:

· 如转入的miRNA带荧光标记如GFP,则可直接在转染后、细胞裂解前,显微镜下观察细胞荧光;

· 如转入的miRNA不带任何荧光标记,可考虑进行miRNA的qRT-PCR检测,通过检测结果判断实验组2、4、6是否相对其对照组miRNA有显著过表达。

· 设置一个荧光质粒转染参照组,同批转染一个组的细胞,间接反映出同批次实验的转染情况。


2.3  阴性结果如何理解?

在确保实验体系无异常的前提下,如最终检测到的结果是阴性结果,则基本可以判断目的miRNA不能直接调控靶基因的表达。如阳性结果和阴性结果都出现过,需进行重复验证,结果一直波动的话可能是实验系统或其他原因。


2.4  实验体系是否可以优化?如何优化?

实验关键点在细胞状态和转染效率,转染效率的优化可通过调整共转染质粒的比例或调整转染体系来进行,设置合理的质粒转染量梯度,观察microRNA对靶基因的抑制是否存在剂量效应或是否存在变化趋势的一致性,从而使结论更加可靠。

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circRNA

circRNA

有别于LncRNAmRNAmiRNA 等这些线性的RNAcircRNA 以其闭环特征成功赢得了广大科研工作者的青睐,成为近来研究的热点。circRNA 由特殊的可变剪切产生,广泛存在于真核细胞内且表达有一定的组织、时序和疾病特异性。circRNA 研究较多的功能有两点:一是充当ceRNA 作为miRNA“海绵,解除miRNA 对编码基因的翻译抑制;二是结合转录相关复合物调控亲本基因表达。但如何实现circRNA “gain of function”“loss of function”调控,对很多人来说是难点。




circRNA 的研究方法


1. circRNA序列的获得

网站:http://www.circbase.org/,输入circRNA名称搜索(以hsa_circ_0032627为例),打开fasta(下图)


hsa_circ_0032627搜索结果



“circRNA sequence”选择“spliced”,下方选“search”即可得到成环序列;选择“genomic”,下方选择“Extend upstream by 1000 bases”即可得到上游延伸1000bp的包含成环以及内含子的序列(下图)。

序列查找界面

2. circRNA过表达构建

目前文献多采用内源性的成环序列上游臂1kb,并生成这1kb的反向互补序列作为下游臂,将这两个臂构建至成环序列上下游并在成环序列两端加上AG-GT剪切序列。这种包含ALU序列及稳定二级结构的构建方式成环效率最高(下图)。

circRNA过表达载体构建方法

3. circRNA干扰靶点设计

由于很多环状RNA属于外显子成环,所以,如果针对成环序列设计,靶点同时会脱靶至本底基因。由此,靶点只能设计在成环接头处,一般一个环状RNA只能设计1-2条靶点。直接在接头处的40-45bp设计靶点即可(下图)。


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注:GV502慢病毒过表达载体应用于circRNA时需经售前优化。

引用文献

1. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. 2018, nature communications (IF=12.353).  吉凯产品:microRNA-down慢病毒  研究领域:肝癌  第二军医大学附属东方肝胆外科医院

2. MicroRNA 301A Promotes Intestinal Inflammation and Colitis-Associated Cancer Development by Inhibiting BTG1. 2017, Gastroenterology (IF=20.773).  吉凯产品:miRNA慢病毒  研究领域:肠道炎症和结肠炎  上海市第十人民医院

3. miR-3188 regulates nasopharyngeal carcinoma proliferation and chemosensitivity through a FOXO1-modulated positive feedback loop with mTOR–p-PI3K/AKT-c-JUN. 2016, Nature Communications (IF=12.353).  吉凯产品:RNAi慢病毒和miRNA慢病毒  研究领域:鼻咽癌  南方医科大学

4. The long intergenic noncoding RNA UFC1, a target of microRNA 34a, interacts with the mRNA stabilizing protein HuR to increase levels of β-catenin in HCC cells. 2015, Gastroenterology (IF=20.773).  吉凯产品:lncRNA干扰慢病毒  研究领域:肝癌  南方医科大学南方医院

5. miR-301a promotes intestinal mucosal inflammation through induction of IL-17A and TNF-α in IBD. 2015, Gut (IF=17.016).  吉凯产品:micro-up,micro-down慢病毒  研究领域:肠粘膜炎症  上海第十人民医院

6. Repression of the Long Noncoding RNA-LET by Histone Deacetylase 3 Contributes to Hypoxia-Mediated Metastasis. 2013, Molecular Cell (IF=14.248).  吉凯产品:lncRNA过表达,干扰慢病毒  研究领域:lncRNA机制研究  第二军医大学东方肝胆医院

7. Silencing circular RNA hsa_circ_0000977 suppresses pancreatic ductal adenocarcinoma progression by stimulating miR-874-3p and inhibiting PLK1 expression. 2018, Cancer Letters (IF= 6.491).  吉凯产品:circRNA干扰慢病毒  研究领域:胰腺癌  南方医科大学珠江医院

8. Long non-coding RNA H19 contributes to apoptosis of hippocampal neurons by inhibiting let-7b in a rat model of temporal lobe epilepsy. 2018, Cell Death and Disease (IF=5.638).  吉凯产品:干扰和过表达LncRNA H19 AAV  血清型:AAV9  研究领域:颞叶癫痫  首都医科大学

9. LncRNA H19 contributes to hippocampal glial cell activation via JAK/STAT signaling in a rat model of temporal lobe epilepsy. 2018, Journal of Neuroinflammation (IF=5.193).  吉凯产品:干扰和过表达LncRNA H19 AAV  血清型:AAV9  研究领域:颞叶癫痫  首都医科大学

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