CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 是一种能够对基因组的特定位点进行精确编辑的技术。其原理是核酸内切酶Cas9蛋白通过导向性RNA(guide RNA, gRNA)识别特定基因组位点并对双链DNA进行切割,细胞随之利用非同源末端连接(Non homologous End Joining,NHEJ)或者同源重组(Homologous Recombination, HR)方式对切割位点进行修复,实现DNA水平基因敲除或精确编辑。

CRISPR基因敲除

利用CRISPR / Cas9 进行单基因敲除


目前研究最透彻、应用最广泛的II 型-CRISPR/Cas9 系统由两部分组成:


1. 单链的guide RNA(single-guide RNA,sgRNA)

2. 有核酸内切酶活性的Cas9 蛋白


CRISPR/Cas9 系统利用sgRNA 来识别靶基因DNA,并引导Cas9 核酸内切酶剪切DNA(图1)。当基因组发生双链DNA 断裂后,细胞通过非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ) 将断裂接合,在此过程中,将随机引入N 个碱基的缺失或增加,若N 非3 的倍数,则目的基因发生移码突变,实现基因敲除。CRISPR 相对ZFN,TALEN 等基因打靶技术而言更为简单,廉价,高效,已经得到广泛应用。

1 CRISPR / Cas9 KO 原理




CRISPR/Cas9 基因敲除优势

RNA 干扰是从mRNA 水平对目的基因进行敲减,而Cas9 是从基因组水平对基因进行敲除,可完全消除目的基因在细胞内的表达,靶蛋白的功能也因此完全丧失。此外,CAS9 靶点选择范围可以扩大到所有基因组序列,如启动子、内含子等等都可以被剪切(表1)。

1 CRISPR/Cas9 基因敲除与RNAi 比较


CRISPR过表达

利用CRISPR / Cas9 进行单基因过表达

通过修饰CRISPR/Cas9 系统中的一些元件,形成一种蛋白复合物-协同激活介质(SAM),可实现对多数细胞内源基因的特异性激活。该系统灵活方便,为研究基因功能提供了极为便利的工具。


CRISPR-SAM 系统由三部分组成:

1. 失去核酸酶活性的dCas9deactivated Cas9-VP64 融合蛋白

2. 含2 个MS2 RNA adapter 的sgRNA

3. MS2-P65-HSF1 激活辅助蛋白


CRISPR-SAM 系统中的MS2-P65-HSF1 激活辅助蛋白就是SAM,全称为SynergisticActivation Mediator( 协同激活调节器),这也就是CRISPR-SAM 的命名由来。CRISPR-SAM 借助dCas9-sgRNA 的识别能力,通过MS2 MS2adapter 的结合作用,将P65/HSF1/VP64 等(均为转录激活因子)拉拢到目的基因启动子区域,成为一种强效的选择性基因活化剂,从而增强基因的转录表达(图2)。




CRISPR-SAM 优势

传统过表达技术受限于载体的容量,只能用于研究一定长度内的基因,且一次只能过表达基因的一个转录本。而SAM 技术通过激活目的基因启动子的方式实现过表达,可以不受基因大小的限制,且一次可以过表达基因的所有转录本,实现整个基因层面的上调。除此之外,这种基于Cas9 系统的基因激活方法还可作为高通量筛选的一个强有力工具。如需要实现多基因,甚至全基因组规模上的基因上调,只需将1 sgRNA 换成含有成千上万个sgRNA 的文库,就能靶向全基因组23,430 个编码元件,实现全基因组水平上的gain-of-function 筛选。

CRISPR文库

吉凯提供CRISPR-pool TM KOUT(敲除)和CRISPR-pool TM SAM(过表达)两种文库。可用于抗肿瘤药物药敏/ 耐药基因等关键性基因的高通量筛选。


1. CRISPR-poolTM KOUT(敲除)文库

高通量敲除基因的慢病毒文库,包含 122411 sgRNA 靶点慢病毒,同时靶向人类基因组中 19050 个编码基因及 1864 microRNA。适合于细胞增殖关键基因、药物敏感关键基因、致死致病原(病毒,细菌等)感染敏感关键基因的高通量功能性筛选。


2. CRISPR-poolTM SAM(过表达)文库

内源性高通量上调编码基因的慢病毒文库,包含 70290 sgRNA 靶点慢病毒,同时靶向 23430 个编码基因转录本。适用于耐药基因、毒性抵抗基因、促细胞增殖基因的高通量功能性筛选。




文库产品特色

1.  针对每一靶基因设计多条sgRNA

2.  文库完整性:质粒覆盖度>98%

3.  文库均一性:丰度最高的10% sgRNA 与丰度最低的10% sgRNA 之间的丰度差异在15 倍之内

4.  文库质粒以慢病毒包裹,感染效率高




文库应用示例


慢病毒敲除/ 过表达文库可高效处理细胞进行抗肿瘤药物/ 致死致病原/ 毒物处理,富集耐药细胞群。收集细胞群进行深度测序获得高丰度sgRNA,以此筛选获得关键抗性基因。


产品介绍

引用文献

1.  Long noncoding RNA lnc-TSI inhibits renal fibrogenesis by negatively regulating the TGF-β/Smad3 pathway. 2018, SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE (IF=16.71). 吉凯产品:CRISPR/Cas9敲除慢病毒  研究领域:肾纤维化  南方医科大学

2.  A Novel Long Non-coding RNA Lnc-HC Binds hnRNPA2B1 to Regulate Expressions of Cyp7a1 and Abca1 in Hepatocytic Cholesterol Metabolism. 2016, Hepatology (IF=14.079). 吉凯产品:CRISPR/Cas9慢病毒  研究领域:肝脏胆固醇代谢  西安交通大学。

3.  Loss of ERα induces amoeboid-like migration of breast cancer cells by downregulating vinculin. 2017, Nature Communications (IF=12.353). 吉凯产品:shRNA和CRISPR/Cas9慢病毒  研究领域:乳腺癌  第四军医大学

4.  HMGB1 represses the anti-cancer activity of sunitinib by governing TP53 autophagic degradation via its nucleus-to-cytoplasm transport. 2018, Autophagy (IF=11.1). 吉凯产品:CRISPR/Cas9慢病毒  研究领域:自噬机制  浙江大学

5.  Long noncoding RNA NEAT1, regulated by the EGFR pathway, contributes to glioblastoma progression through the WNT/β-catenin pathway by scaffolding EZH2. 2018, Clinical Cancer Research (IF=10.199). 吉凯产品:Cas9、luciferase慢病毒 研究领域:胶质母细胞瘤 哈尔滨医科大学第二附属医院

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