Science子刊 | 南方医科大学侯凡凡院士课题组揭示LncRNA作为抑制肾脏纤维化的新靶点

2019-06-12

肾脏纤维化是各种进展性肾脏病发展为终末期肾衰竭的共同通路。TGF-β被认为是最重要最强烈的肾脏纤维化的诱导因子。在TGF-β刺激下,Smad3蛋白的磷酸化过程被认为是整个通路最核心的环节。

过去关于肾脏纤维化的研究主要集中于关键蛋白编码基因上,然而,随着分子生物学机制研究的发展,人们发现表观遗传学在肾脏间质纤维化的发展中同样起着重要作用。

在分子生物学界,主流思想认为蛋白质是一切生命过程的执行者,而DNA和RNA只是合成蛋白质的蓝图和工厂。然而,随着对人类基因组的揭秘,人们惊讶地发现,绝大部分的DNA和RNA根本不直接参与蛋白质的翻译合成。这些前期被认为“转录噪音”的长链非编码RNA被证明参与了多种生理或者疾病过程,成为信号转导通路里面的“关键节点分子”或者作为疾病中的潜在的干预靶点。

最近,南方医科大学侯凡凡院士研究团队首次报道了人类肾小管上皮细胞中特异地表达长链非编码RNA-lnc-TSI,在促纤维化因子TGF-β刺激下lnc-TSI表达明显上调,在生物学功能上,lnc-TSI通过抑制Smad3的磷酸化阻断TGF-β/Smad3通路活化,从而抑制肾脏纤维化的发展,相关研究成果在2018年10月以“Long noncoding RNA lnc-TSI inhibits renal fibrogenesis by negatively regulating the TGF-β/Smad3 pathway”为题发表在国际期刊Science Translational Medicine(2018年影响因子IF 16.71)上。


在前期研究中我们发现在TGF-β1刺激下,长链非编码RNA lnc-TSI在肾小管上皮细胞系HK2和HKC8中明显上调(图1A)且主要定位于细胞质中(图1B)。


图 1


在研究lnc-TSI的生物学功能和分子机制时,我们首先采用了在肾小管上皮细胞HK2中过表达lnc-TSI的研究方法。Western blot显示相比于过表达空载组,过表达lnc-TSI的细胞中的TGF-β1导致的pSmad3的磷酸化水平明显下降(图2 A),TGF-β1导致的促纤维化基因的表达也受到抑制(图2 B),Smad3的核转位也明显减少(图2 C)。免疫共沉淀实验显示过表达lnc-TSI可以有效降低TGF-β1刺激下TGFβ I型受体与Smad3的结合,且此抑制相应呈现剂量依赖效应(图2 D)。


图 2


接下来我们使用了CRISPR-Cas9慢病毒(由上海吉凯基因公司提供设计和包装)进行lnc-TSI的敲除,结果显示慢病毒有效敲降lnc-TSI使其表达水平至对照组的10%以下(图3 A)。在生物学功能上,我们发现相比于阴性对照,敲除lnc-TSI后可以增强TGF-β1导致的pSmad3的磷酸化水平(图3 B),增加TGF-β1导致的促纤维化基因的表达(图3 C),增加TGF-β1导致的Smad3的核转位(图3 D)。免疫共沉淀实验显示过表达lnc-TSI可以有效加强TGF-β1刺激下TGFβ I型受体与Smad3的结合(图2 E)。


图 3


为了研究lnc-TSI对肾间质纤维化的影响,我们实施了小鼠单侧输尿管结扎(Unilateral Ureteral Obstruction, UUO)模型,实验设计为单侧输尿管结扎术前7天进行肾静脉原位注射通过腺相关病毒,在造模后7天处死小鼠(图 4A)并收集肾脏组织进行检测lnc-TSI的表达和UUO所致的肾间质纤维化病变程度。Northern blot显示通过AAV9可以成功在小鼠肾脏中表达lnc-TSI(图4B)。在小鼠肾脏中特异过表达lnc-TSI可以有效减轻单侧输尿管结扎(UUO)所致的肾间质纤维化(图4C),表现为肾间质纤维化评分(TIF index)降低(图4D)和肾小管中pSmad3蛋白的表达下降(图4E)。

图 4


最后我们慢性肾脏病队列研究中检测了lnc-TSI和肾间质纤维化进展的观察性研究。RNA原位杂交结果显示在慢性肾脏病患者的肾脏活检组织中,lnc-TSI的表达水平与肾间质纤维化的严重程度呈明显负相关(图4 A&B)。同时也可观察到,lnc-TSI的表达水平和pSmad3的表达水平呈负相关(图4 C)。在一组长期随访、接受了重复肾活检的慢性肾脏病患者组织标本中,首次肾活检时肾脏lnc-TSI表达较低的患者4年后肾纤维化的进展和肾功能减退较lnc-TSI表达较高者更为严重(图4 D&E)。

图 5


作者简介

王鹏,南方医科大学肾内科2016级博士研究生,主要研究方向为肾脏疾病中的表观遗传学调控。

罗曼莉教授,中山大学孙逸仙纪念医院医学研究中心副主任,主要研究方向为长链非编码RNA在恶性肿瘤中的作用。

南方医科大学侯凡凡院士为本文的通讯作者,南方医科大学王鹏和中山大学孙逸仙纪念医院罗曼莉教授为本文的共同第一作者。